Riassunto analitico
La Palmitoiletanolammide (PEA) è una molecola lipidica endogena con struttura simile a quella degli endocannabinoidi, implicata nella regolazione di diversi processi, inclusi la percezione del dolore e la modulazione degli stati infiammatori. Ad oggi viene utilizzata in integratori alimentari, cosmetici e dispositivi medici ma, grazie ai suoi potenti effetti neuroprotettivi e anti-infiammatori, può essere presa in considerazione per il trattamento di diverse patologie, tra cui quelle infiammatorie. Tuttavia, PEA non è impiegata come farmaco poiché i suoi effetti biologici sull’organismo sono difficilmente dimostrabili a causa della sua scarsa solubilità e conseguente difficoltà a superare le barriere biologiche. Per ovviare a questi problemi è possibile utilizzare Drug Delivery Systems, come le nanoparticelle lipidiche solide (SLNs) e le nanoparticelle polimeriche di acido poli-lattico-co-glicolico (npPLGA).
Durante il lavoro di tesi, sono state ottimizzate e caratterizzate SLNs inalabili per un possibile trattamento di patologie infiammatorie polmonari e SLNs e npPLGA iniettabili destinate alla somministrazione intramuscolare per il trattamento della sarcopenia, una malattia legata all’età caratterizzata dalla progressiva perdita di massa muscolare e dal declino della funzionalità muscolo-scheletrica.
Tutti i sistemi sono stati caratterizzati dal punto di vista morfologico, attraverso Scanning e Transmission Electron Microscopy, e dimensionale, mediante l’uso della Photon Correlation Spectroscopy. Inoltre, sono stati condotti studi di rilascio in vitro in confronto con il profilo di dissoluzione di PEA libera.
Dagli studi dimensionali e morfologici è emerso che le nanoparticelle risultavano di circa 200 nm con una forma prevalentemente sferica. Dagli studi di rilascio in tampone fosfato è emerso il diverso comportamento dei due tipi di sistemi. Infatti le npPLGA mostravano un rilascio prolungato nel tempo mentre le SLNs un rilascio più veloce con un “burst effect” iniziale; PEA libera, invece, risultava completamente insolubile nei diversi mezzi di dissoluzione valutati.
Per quanto riguarda le SLNs inalabili, sulla polvere liofilizzata in presenza di un crioprotettore è stato effettuato il test di respirabilità, di determinazione della densità e dell’angolo di riposo, per investigare la possibile somministrazione mediante inalatori a polvere secca. Inoltre, sono stati effettuati test su una linea cellulare macrofagica alveolare, MH-S, per determinare la citotossicità e capacità di internalizzazione cellulare. Le analisi sulla polvere hanno mostrato promettenti risultati di respirabilità e buoni valori di scorrevolezza. Gli studi in vitro sui macrofagi alveolari hanno evidenziato come le SLNs non risultino citotossiche e vengano internalizzate con un’intensità pari al 90% già dopo un’ora rispetto al 40% riscontrato dopo 3 ore con PEA libera.
Relativamente alle SLNs e npPLGA destinate alla somministrazione intramuscolare, sono stati condotti test di citotossicità sulla linea cellulare mioblastica C2C12 e di risposta anti-infiammatoria sulle cellule mioblastiche infiammate mediante trattamento con lipopolisaccaride (LPS). I risultati, per ora disponibili solo per le SLNs, hanno mostrato una riduzione dei valori di TNF-alfa sia nelle cellule trattate con PEA libera che con PEA caricata in SLNs; al contrario, le particelle non caricate (SLNs-bianche) non hanno mostrato variazioni di questo fattore, indicando l’effettiva efficacia dell’endocannabinoide veicolato.
In conclusione, i risultati di questo lavoro contribuiscono ad evidenziare il vantaggio dell’uso di Drug Delivery Systems nella veicolazione polmonare e intramuscolare di PEA, riuscendo a superare gli ostacoli riscontrati con la molecola non veicolata.
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Abstract
Palmitoylethanolamide (PEA) is an endogenous lipid molecule, with an endocannabinoid-like structure, involved in the regulation of different processes, including pain perception and modulation of inflammatory states. Today it is used in nutritional supplements, cosmetics and medical devices but, thanks to its powerful analgesic, neuroprotective and anti-inflammatory effects, it can be considered for the treatment of different pathologies, including inflammatory diseases. However, PEA is not used as a drug due to its low solubility and consequent difficulty to cross biological barriers. To overcome this problem, Drug Delivery Systems, such as Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) and poly-lactic-co-glycolic acid nanoparticles (npPLGA) can be proposed.
During the thesis work, inhalable SLNs for a possible treatment of pulmonary inflammatory diseases and injectable SLNs and npPLGA for intramuscular administration for the treatment of sarcopenia were optimized and characterized. Sarcopenia is an age-related disease characterized by the progressive loss of muscle mass and decline in musculoskeletal function,
All the systems were characterized from the morphological point of view through Scanning and Transmission Electron Microscopy (SEM and TEM) and dimensionally using Photon Correlation Spectroscopy (PCS). Furthermore, in vitro release studies were conducted in comparison with the dissolution profile of raw PEA.
The dimensional and morphological studies showed that all nanoparticles were approximately 200 nm with a predominantly spherical shape. The release studies in phosphate buffer highlighted the different behaviour of the two types of systems. In fact, npPLGA showed a prolonged release over time, while SLNs showed a faster release with a "burst effect"; raw PEA, on the contrary, was completely insoluble in the dissolution media evaluated.
Regarding inhalable SLNs, respirability tests and analysis of density and angle of repose on powders freeze-dried in the presence of a cryoprotectant were carried out to investigate the possible administration by Dry Powder Inhaler device (DPI). In addition, in vitro tests were carried out on alveolar macrophage cell line, MH-S, to determine SLNs cytotoxicity and cellular internalization. The analysis of freeze-dried powder showed promising results of respirability and suitable flowability values. In vitro studies on MH-S showed that SLNs were not cytotoxic and were internalized after 1h treatment with an intensity of 90%, compared to 40% observed after 3 h with raw PEA.
Regarding SLNs and npPLGA intended for intramuscular administration, cytotoxicity tests and anti-inflammatory response tests were performed on C2C12 myoblast cell line treated with lipopolysaccharide (LPS). The results, available for now only for SLNs, showed a reduction in TNF-alpha values both in cells treated with raw PEA and with PEA-SLNs; on the other hand, unloaded SLNs did not show any variations of this factor, indicating the actual efficacy of the encapsulated endocannabinoid.
In conclusion, the results of this work contribute to highlighting the advantage of using Drug Delivery Systems in the pulmonary and intramuscular delivery of PEA, overcoming the obstacles observed with the free molecule.
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