Riassunto analitico
L'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e la guanosina monofosfato ciclico (cGMP) rappresentano i principali secondi messaggeri coinvolti nella trasduzione del segnale intracellulare. Queste molecole regolano numerosi aspetti funzionali cellulari attraverso l'attivazione di proteine ad attività chinasica, quali la proteina chinasi A (PKA) e la proteina chinasi G (PKG), rispettivamente. L'aumento dei nucleotidi ciclici intracellulari è regolato dalle fosfodiesterasi, enzimi deputati alla rottura dei legami fosfodiesterici.
Lo scopo di questo studio è quello di valutare l'attivazione di segnali di morte o proliferazione cellulare mediata da nucleotidi ciclici, in linee cellulari tumorali tiroidee a differente grado di malignità. Tali cellule sono le "K1", derivanti da tumore papillare tiroideo, ed "Nthy-ori", linea immortalizzata di cellule follicolari. La linea cellulare COS7 è stata utilizzata come confronto.
Ho valutato gli effetti sulla vitalità cellulare tramite il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolio (MMT), stimolando le cellule con diverse concentrazioni (range 1 pM-1 M) e rilevando l'assorbanza mediante spettofotometro dopo 24 e 48 h di trattamento. L'analisi del cell signalling è stata eseguita valutando la fosforilazione di extracellular-regulated kinases (ERK1/2), proteina chinasi B (AKT), cAMP responsive element-binding-protein (CREB) e cleavage della procaspasi 3, mediante Western blotting. Attraverso la tecnica bioluminescence resonance energy transfer (BRET) ho analizzato l'aumento intracellulare di ioni Ca2+. La trascrizione dei geni anti- e pro-apoptotici, rispettivamente, c-MYC e TP53, verrà valutata mediante real time PCR e il cleavage delle procaspasi 3 mediante immunofluorescenza.
Il saggio MTT ha rivelato che, in tutte le linee cellulari, sia 8-br-cAMP che 8-br-cGMP 1 M inducono un calo della vitalità cellulare dopo 24-48 h di trattamento. 1 M 8-br-cAMP e 8-br-cGMP inducono fosforilazione di CREB ed ERK1/2, mentre la fosforilazione di AKT indotta dagli analoghi dei nucleotidi ciclici è stata rilevata soltanto nella linea cellulare COS7. In tutte le linee cellulari, 8-br-cAMP e 8-br-cGMP inducono aumento intracellulare di ioni Ca2+, seguendo differenti cinetiche.
Ulteriori esperimenti chiariranno ulteriormente il ruolo dei nucleotidi ciclici marcati nella trascrizione dei geni pro- e anti-apoptotici, tuttavia, i risultati ottenuti indicano che il trattamento con 8-br-cAMP è associato specificamente a calo della vitalità nella linea tumorale benigna tiroidea, ma non in quella maligna (K1). Invece, 8-br-cGMP riduce la vitalità in entrambi i modelli. Tali risultati forniscono nuove basi per comprendere lo specifico ruolo dei nucleotidi ciclici nella crescita di cellule tumorali tiroidee.
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