Riassunto analitico
La sfingosina-1 fosfato (S1P) è un lisosfingolipide presente nel fluido follicolare e associato a lipoproteine ad alta densità (HDL). S1P agisce su recettori specifici, accoppiati a proteina G, espressi in cellule della granulosa. Queste sono implicate nello sviluppo del follicolo ovarico e la maturazione dell’ovocita, mediando la sintesi degli ormoni steroidei. Queste cellule esprimono sia i 5 recettori di S1P (S1PRs), in particolare S1PR1 e S1PR3, i quali attivano le vie di trasduzione del segnale extracellular-regulated kinase (ERK1/2)-, protein kinase B (AKT)- e phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-pathway, implicate nella regolazione di eventi proliferativi, anti-apoptotici e steroidogenici. Con questo studio ho caratterizzato l’azione della sfingosina-1-fosfato (S1P) mediata dai suoi recettori, in cellule primarie della granulosa umane (hGLC) e nella linea cellulare della granulosa immortalizzata hGL5. Tali cellule sono state stimolate con S1P, con agonista di S1PR1 “SEW2871” e agonista di S1PR3 “CYM5541”, quindi ho caratterizzato la fosforilazione del fattore di trascrizione cAMP responsive element binding protein (pCREB), valutata mediante Western blotting, l’aumento intracellulare di ioni calcio (Ca2+) mediante tecnica bioluminescence resonance energy transfer (BRET) e la produzione dell’ormone progesterone, mediante immunoassay. Inibitori specifici di MEK, PKA, Ca2+ e antagonisti di S1P sono stati utilizzati al fine di caratterizzare le vie di trasduzione del segnale coinvolte nell’attivazione di pCREB. Dati preliminari hanno dimostrato che l’attivazione di pCREB, indotta da S1P e agonisti, è cAMP indipendente e non è associata a proliferazione cellulare. Inoltre, ho dimostrato che tale attivazione non è associata a sintesi degli ormoni steroidei. In entrambi i modelli cellulari, ho dimostrato che S1P e SEW2871 inducano l’aumento intracellulare di Ca2+, il quale persiste in presenza degli inibitori fucoidan e verapamil. La fosforilazione di CREB S1P-mediata è mantenuta anche in presenza dell’inibitore di PKA (H-89), mentre viene parzialmente smorzata dall’inibitore di MEK (U0126). L’utilizzo contemporaneo di entrambi gli inibitori di MEK e fosfolipasi C (LY294002) indica che l’attivazione di pCREB mediata da S1P è sostenuta da entrambe queste pathways. Il CRE-reporter assay potrà fornire ulteriori indicazioni sul significato biologico della fosforilazione di CREB indotta da S1P. Tali dati forniscono la caratterizzazione del meccanismo di azione di S1P nel follicolo ovarico umano.
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