Riassunto analitico
La presente Tesi Sperimentale di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stata svolta mediante una mobilità internazionale dal Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia alla Facoltà di Chimica del Vassar College (NY), nel periodo Agosto 2015, Gennaio 2016. Il progetto di ricerca è stato svolto presso il Dipartimento di Chimica sotto la supervisione della Professoressa Miriam Rossi.
Il progetto di ricerca è stato incentrato sulla relazione tra la struttura chimica e l’attività biologica di Hispolon [6-(3,4- diidrossifenil)-4-idrossiesa-3,5-dien-2-one], uno dei composti bioattivi del Phellinus linteus, rinomato fungo con proprietà farmaceutiche. Oggetto dello studio sono stati sette suoi composti analoghi e tre composti strutturalmente correlati, che differiscono per aggiunta di una catena laterale, con lo scopo di imitare uno dei metaboliti attivi del tamoxifene.
Hispolon e i sette analoghi sono stati sintetizzati in India da NATSOL Laboratories, attraverso la condensazione di acetilacetone e idrossibenzaldeide propriamente protetta. Studi precedenti hanno rivelato che alcuni di questi composti inducono apoptosi nelle cellule tumorali, ma i meccanismi non sono ancora chiari.
Basandoci sui saggi MTT, eseguiti in vitro per valutare la loro attività antiproliferativa su linee cellulari tumorali, che ne hanno confermato l’attività, abbiamo proceduto con un’analisi più approfondita sulla relazione struttura-attività.
Gli Hispolon inibiscono la crescita delle cellule attraverso la modulazione di ER nelle cellule tumorali del seno positive all’estrogeno e potrebbero essere validi chemioterapici per la cura del tumore al seno.
Il primo obbiettivo della ricerca è stato quello di ottenere la struttura tridimensionale dettagliata di tutti i composti; abbiamo quindi proceduto con la cristallizzazione dei campioni ed eseguito analisi diffrattometriche a raggi X usando il diffrattometro BRUKER SMART APEX II e i programmi SHELXTL per risolvere e perfezionare le strutture.
Grazie a questi dati siamo stati in grado di procedure con gli studi di docking, servendoci del software Discovery Studio 4.5 per esaminare i complessi che Hispolon e i sette analoghi formano con il recettore estrogenico alfa (codice PDB: 3ERD e 3ERT), sovra-espresso in circa il 70% dei casi di carcinoma mammario ER-positivi.
Abbiamo ipotizzato che il loro legame con il recettore vedesse impiegato lo stesso sito attivo utilizzato dal tamoxifene; quindi, con i nostri composi, abbiamo deciso di imitare il 4-idrossitamoxifene perché è un antagonista nel tumore al seno ed è perciò usato nel trattamento del carcinoma mammario. Esercita la sua azione come antitumorale e chemiopreventivo, antagonizzando l’azione dell’estradiolo, tramite il legame che forma con il sito attivo di ER, provocando un cambiamento di conformazione della proteina, che diventa incapace di legare estrogen response element (ERE).
I risultati riportati in questo studio sono in accordo con i dati sperimentali, investigano nuovi structure-based compounds e fanno luce sul sito di legame.
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Abstract
This experimental thesis of in Pharmaceutical Chemistry and Technology was carried out as a free-mover student from the Department of Life Sciences of the University of Modena and Reggio Emilia to the Faculty of Chemistry of the Vassar College (NY) in the period between August 2015 and January 2016. The research work was performed at the Chemistry Department under the supervision of Professor Miriam Rossi.
This research project is focused on the relationship between the chemical structure and the biological activity of Hispolon [6-(3,4- dihydroxyphenyl)-4-hydroxyhexa-3,5-dien-2-one], one of the bioactive compounds of Phellinus linteus, a well-known medical fungus. Seven of its analogs and three structure-based compounds that varied in inclusion of a side chain, drawn to imitate one of the tamoxifen’s active metabolite (4-hydroxytamoxifen) were investigated for this thesis.
Hispolon and its analogs were synthesized in India by NATSOL Laboratories through the condensation of appropriately protected hydroxybenzaldehydes with acetylacetone. Previous studies have revealed that some of these compounds induce cancer cell apoptosis; however, the mechanisms are not fully understood.
Based on the in vitro cell MTT assay, made to evaluate their anti-proliferative activities on human cancer cell lines, that proved their activity, we proceeded with more in depth analysis on their structure-activity relationship. Hispolon inhibits cell growth through modulation of ER in estrogen-positive breast cancer cells and could be effective in human breast cancer chemotherapy.
The primary aim of our research was to obtain a detailed three dimensional structure of the compounds; thus, we crystallized our samples and performed X-ray diffraction analysis by using the BRUKER SMART APEX II Diffractometer and SHELXTL programs to solve and refine the structures. Thanks to these data, we were able to proceed with the Docking studies by using the Discovery Studio 4.5 to explore the complex of Hispolon analogs with the Human Estrogen Receptor alpha (PDB code: 3ERD and 3ERT), over-expressed in around 70% of breast cancer cases, and referred to as “ER-positive”.
We hypothesized that their binding with the receptor would exploit the same active site as the Tamoxifen; so with our compounds, we decided to imitate 4-hydroxytamoxifen, because it is an antagonist in breast cancer and it is, therefore, used as a breast cancer treatment. It exerts its action as a breast cancer drug/chemoprevention agent by antagonizing the action of estradiol, by its binding to the ligand binding domain of ER and provoking a conformational state of the protein that is incapable of binding to the estrogen response element (ERE).
The results shown in this study are in good agreement with the literature data, explore some new structure-based drugs and shed light on their protein receptor binding sites.
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