Riassunto analitico
Riassunto Analitico
Gli anticoagulanti sono farmaci utilizzati per prevenire e trattare la trombosi venosa, con l'obiettivo di interrompere la formazione di coaguli di sangue. Warfarin (WAR), l'anticoagulante più utilizzato, presenta svantaggi come una finestra terapeutica limitata e rischi potenziali come l'emorragia cerebrale, che portano alla necessità di monitorare i suoi livelli circolanti per garantirne l'efficacia terapeutica. D'altra parte, i nuovi anticoagulanti orali, come dabigatran (DABI), rivaroxaban (RIVA) e apixaban (API), offrono un'alternativa più sicura rispetto a WAR e l'impiego del monitoraggio terapeutico dei farmaci (TDM) non è normalmente richiesto. Tuttavia, in situazioni di emergenza e per popolazioni specifiche, il TDM è obbligatorio per questi composti. Pertanto, l'obiettivo principale del lavoro è stato lo sviluppo di un metodo di cromatografia liquida ad alta prestazione con rivelazione UV/Vis per la quantificazione simultanea di questi quattro agenti anticoagulanti nel plasma umano. Per stabilire il metodo cromatografico, sono stati studiati diversi parametri, in particolare il tipo di colonna (Kinetex® core-shell C18, Chromolith® RP-18e e Chromolith® Phenyl), la composizione della fase mobile, il volume di iniezione (10, 20, 30, 40 e 50 μL) e la velocità di flusso. La separazione cromatografica è stata ottenuta in 11 minuti, utilizzando una colonna monolitica fenilica e un'eluizione a gradiente con una soluzione acquosa di acido formico (0,1%, v/v) e acetonitrile con lo 0,1% (v/v) di acido formico come componenti della fase mobile, a una velocità di flusso di 2 mL/min.
Il metodo è stato convalidato secondo le linee guida dell'Agenzia Europea dei Medicinali e dell'International Council for Harmonisation ed è risultato specifico, accurato (85,7-115,0%) e preciso sia per i dosaggi intra che inter-giornalieri (CV ≤ 9,4%). I valori LOD e LOQ sono stati determinati sia in fase mobile che in plasma. Per tutti gli analiti, i valori di LOD sono stati ≤0,22 µg/mL, mentre i valori di LOQ sono stati ≤0,49 µg/mL. I campioni erano stabili per 24 ore dalla preparazione a temperatura ambiente; la stabilità era mantenuta anche dopo tre cicli di congelamento/scongelamento per tutti gli analiti ad eccezione di DABI, che ha mostrato valori di accuratezza ≤ 67,1%.
I risultati dimostrano quindi che il metodo proposto ha permesso la separazione simultanea dei quattro analiti target e mostra potenziale per essere applicato alla loro analisi in diverse bio-matrici, in particolare campioni non invasivi (ad es. urine) e formulazioni farmaceutiche, nonché per l'applicazione a pazienti in trattamento.
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Abstract
Abstract
Anticoagulants are drugs used to prevent and treat venous thrombosis, aiming to disrupt blood clot formation. Warfarin (WAR), the most used anticoagulant, has drawbacks like a restricted therapeutic window and potential risks like cerebral bleeding, leading to the need to monitor its circulating levels to ensure therapeutic efficacy. On the other hand, the new oral anticoagulants, like dabigatran (DABI), rivaroxaban (RIVA), and apixaban (API), offer a safer alternative compared to WAR, and the implementation of therapeutic drug monitoring (TDM) is normally not required for them. However, for emergency situations and specific populations, TDM is mandatory for these compounds. Thus, the main goal of this work was the development of a high-performance liquid chromatographic method with UV/Vis detection for the simultaneous quantification of four anticoagulant agents in human plasma. To establish the chromatographic method, several parameters were studied, namely the type of column (Kinetex® core-shell C18 column, Chromolith® RP-18e column and Chromolith ® Phenyl column), mobile phase composition, injection volume (10, 20, 30, 40, and 50 μL), and flow rate. Chromatographic separation was achieved in 11 min, using a monolithic phenyl column and gradient elution with an aqueous solution of formic acid (0.1%, v/v) and acetonitrile with 0.1% (v/v) formic acid as mobile phase components, at a flow rate of 2 mL/min.
The method was validated according to the European Medicines Agency and the International Council for Harmonisation guidelines, and it was found to be specific, accurate (85.7–115.0%), and precise for both intra and inter-day assays (CV ≤ 9.4%). LOD and LOQ values were determined both in mobile phase and plasma. For all analytes, LOD values were ≤0.22 µg/mL, meanwhile LOQ values were ≤0.49 µg/mL. Freshly prepared samples of the four compounds showed stability after 24 h at room temperature. Moreover, after three freeze–thaw cycles, all compounds maintained stability apart from DABI, which exhibited accuracy values ≤ 67.1%.
Thus, the results show that the proposed method allowed simultaneous separation of the four target analytes and show potential to be further investigated for determination of the four drugs in different biomatrices, namely non-invasive samples (e.g. urine) and pharmaceutical formulations, as well for application to patients under treatment.
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