Riassunto analitico
La pandemia da SARS-CoV-2 si è manifestata più frequentemente con sintomi che interessano le basse vie respiratorie, progredendo per una minoranza di pazienti verso la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e danno alveolare diffuso. La fisiopatologia dell’infezione da coronavirus è correlata ad elevati livelli di citochine infiammatorie con polmonite come conseguenza dell’eccessiva attivazione dei monociti. L’infiammazione può essere accompagnata da fibrosi, processo che prevede accumulo di tessuto connettivo fibroso ed eccesso di matrice extracellulare (ECM). Le cellule effettrici della fibrosi sono i miofibroblasti, che si differenziano a partire dai fibroblasti. I monociti sono cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo importante nell’omeostasi, nell’attivazione immunitaria e nell’immunosoppressione. Questi vengono modulati nella loro azione dal rilascio di fattori paracrini da parte delle cellule staminali adulte (MSC). Tra queste ultime le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSCs) risultano essere cellule a bassa immunogenicità. Lo scopo della tesi è quello di osservare il comportamento dei fibroblasti in ambiente infiammatorio e profibrotico di induzione virale. Si è presa in analisi l’espressione di geni e proteine profibrotici e proinfiammatori, valutando successivamente la presenza di una modulazione degli stessi a seguito di un contatto con il surnatante di monociti wild type e attivati in co-coltura diretta e indiretta con hDPSC. A tal fine è stato allestito un modello in vitro di fibro-infiammazione mediante l’utilizzo di fibroblasti umani isolati da cute di donatori sani di età avanzata. I monociti sono stati attivati con CL097, un’imidazo-chinolina agonista del Toll-Like Receptor 7/8, per mimare un’infezione virale e poi caratterizzati mediante analisi citofluorimetica. I fibroblasti sono stati saggiati con il mezzo condizionato ottenuto da questi monociti e l’effetto è stato verificato in real-time PCR e western blot. Successivamente i fibroblasti sono stati trattati con il mezzo condizionato ottenuto dalla co-coltura diretta e indiretta tra hDPSC e monociti attivati per 48 ore, e il livello di espressione dei principali mediatori dell’infiammazione quali TNFα e dei fattori profibrotici come fibronectina (FN1), collegane di tipo I (Col1A) o αSMA sono stati determinati in real-time PCR, western blot, immunofluorescenza e con metodica ELISA. Le hDPSC sono state isolate da polpe dentali di soggetti sani ed immunoselezionate mediante magnetic cell sorting (MACS) per gli antigeni di superficie c-Kit e STRO-1. Dopo 48 ore di trattamento dei fibroblasti con il mezzo condizionato di monociti attivati, si è osservato un aumento di espressione dei geni proinfiammatori (IFNγ, Il-6 e IL-1β), mentre l’esposizione prolungata al mezzo condizionato per sette giorni induce l’aumento dei geni profibrotici FN1 e αSMA e della metalloproteinase 2 (MMP2) e il calo di espressione di Col1A. Nei fibroblasti, dopo esposizione di 48 ore al mezzo condizionato di monociti attivati mantenuti in co-coltura con hDPSC, è stata osservata una ulteriore riduzione di espressione di Col1A, ma anche di COX2 e HLADRB1, effetto che permane anche dopo 7 giorni di trattamento, e ad un aumento di espressione di MMP2. Ciò indica come l’induzione di un ambiente infiammatorio di tipo virale nei fibroblasti sia responsabile dell’attivazione precoce di geni proinfiammatori e in seguito di geni profibrotici, e che il contributo fornito dalle hDPSC sia immunomodulatorio a carico di HLA-DRB1 e COX2, antinfiammatorio downregolando IFNγ e antifibrotico inducendo il rimodellamento dell’ECM inibendo αSMA e Col1A e aumentando MMP2.
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