• calcium
• DMD
• hypertrophy
• NOX4
• ROS

La Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia muscolare legata al cromosoma X caratterizzata da una completa carenza di distrofina, causa di danno muscolare scheletrico progressivo e morte prematura. Si sospetta che l’aumento di calcio intracellulare, l’eccessiva perossidazione lipidica e produzione di Specie Radicaliche dell’Ossigeno (ROS) contribuiscano alla patologia della malattia. Le NADPH ossidasi (NOXes) sono state considerate una delle principali fonti di produzione di ROS nella malattia e sono state identificate come sovra-espresse nei muscoli dei topi mdx (il modello murino di DMD); in particolare, dati che provengono dal nostro laboratorio indicano che l’isoforma NOX4 sia la più decisiva nel danno indotto in questa patologia. Per chiarire il ruolo dell’isoforma NOX4 nella patologia sono stati utilizzati e confrontati un modello murino distrofico, il modello N4(D)MC, in cui è stata indotta selettivamente nel muscolo scheletrico la rimozione genetica di NOX4, e il suo controllo, il modello (D)MC. Nel modello N4(D)MC l’espressione di NOX4 è stata inibita in modo muscolo specifica in seguito ad un breve trattamento con Doxiciclina. La generazione di ROS e la quantificazione di calcio sono stati misurati, attraverso Live Cell Imaging, utilizzando rispettivamente le sonde Cell ROX Deep Red e FURA2-AM, caricate su fibre muscolari del Flexor Digitorum Brevis (FDB) isolate da topi N4(D)MC e (D)MC. Topi distrofici NOX4-deficienti hanno mostrato sorprendenti livelli ridotti di ROS rispetto ai topi DMC (topi distrofici con il gene NOX4 espresso), risultato che dimostra un coinvolgimento di NOX4 nella fisiopatologia della malattia. Anche l’influsso di calcio è stato visto essere ridotto nei topi N4DMC, tuttavia non raggiungendo la significatività statistica. Inoltre, i topi N4DMC hanno dimostrato un’ipertrofia muscolare significativamente ridotta rispetto al fenotipo wild-type e DMC, come visto dal peso dei muscoli estratti da diversi modelli di topi.
Questi risultati hanno rafforzato il ruolo centrale svolto da NOX4 nella fisiopatologia della DMD, suggerendo questa isoforma come un target promettente per i futuri approcci terapeutici. Lo studio ha anche esaminato gli effetti di una nuova small molecule, il GSK2795039 (MedChemExpres, USA), inibitore della NOX2, al fine di valutare il suo effetto sullo stress ossidativo incontrato nella malattia. La produzione di ROS è stata misurata in miotubi di modelli DMC, utilizzando una delle sonde attualmente più utilizzate, la dicloro-diidro-fluoresceina diacecetato (DCFH-DA).
Il lavoro svolto si è occupato inoltre di indagare sugli effetti che il GSK2795039 ha sulla generazione di forza di muscoli Exstensor Digitorum Longus (EDL) isolati, in seguito ad esposizione a contrazioni eccentriche, contrazioni conosciute per essere particolarmente dannose per i muscoli distrofici. Nei miotubi distrofici, il lead compound ha inibito la produzione di ROS rispetto al controllo (miotubi non trattati), raggiungendo lo stesso livello di inibizione della Diapocinina, il nostro composto di riferimento. La Diapocinina, utilizzata come controllo positivo, è un inibitore semisintetico delle NADPH ossidasi che ha mostrato grande efficacia in modelli murini distrofici. I risultati ottenuti si sono quindi confermati estremamente incoraggianti. D’altra parte, il GSK2795039 non ha dimostrato di prevenire la perdita di forza indotta da contrazioni eccentriche in muscoli distrofici. A causa del basso numero di muscoli analizzati, saranno necessari però ulteriori studi per consolidare questi risultati.
In conclusione, i nuovi modelli murini generati, N4(D)MC/(D)MC, e il selettivo targeting di NOXes usando small molecules sono stati prova del potenziale che questo target ha nei modelli di DMD. Sono però necessari ulteriori studi per chiarire il suo ruolo nella cascata fisiopatologica della malattia.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked muscular disease characterized by a complete dystrophin absence which results in progressive skeletal muscle damage and finally in premature death. Elevation of intracellular calcium, exaggerated lipid peroxidation and excessive Reactive Oxygen Species (ROS) production are reported to contribute to the pathology of the disease. NADPH oxidases (NOXes) have been identified as a major source of ROS in DMD and have been reported to be over-expressed in muscles of mdx mice (the mouse model of DMD); in particular, data from our lab puts NOX4 isoform to be more decisive in the damage induced in this pathology. To elucidate the role of NOX4 isoform in the pathology, a dystrophic mouse model enabling the genetic removal of NOX4 selectively from skeletal muscle and its control, the N4(D)MC and (D)MC mice respectively, were generated and compared. NOX4 expression was abolished in the N4(D)MC mice in a muscle-specific manner upon a brief doxycycline treatment. Muscle ROS generation and calcium concentrations were measured using live cell imaging of Cell ROX Deep RED and FURA 2-AM probes in isolated Flexor Digitorum Brevis (FDB) muscular fibers prepared from the N4(D)MC and (D)MC mice. Dystrophic NOX4-deficient mice (N4DMC) exhibited reduced levels of ROS compared with DMC mice (dystrophic mice with intact NOX4 gene expression), indicating that NOX4 is strongly implicated in the pathophysiology of the disease. Ca2+ influx was also attenuated in N4DMC mice, however not reaching statistical significance. Furthermore, N4DMC mice demonstrated significantly reduced muscular hypertrophy compared with wild type and DMC mice, as seen by the corrected weight of muscles extracted from the different mice models. These findings reinforced the central role played by NOX4 in DMD pathophysiology, suggesting this isoform as a promising target for future therapeutic approaches. The study also examined the effects of a small novel molecule NOX2 inhibitor, GSK2795039 (MedChemExpress, USA), in order to assess its effect on the oxidative stress encountered in the disease. ROS production was measured using one of the most currently probe, dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), in DMC myotubes. We have also investigated the effects of GSK2795039 on force generation of isolated Extensor digitorum longus EDL muscles exposed to eccentric contractions, contractions known to be particularly damaging to dystrophic muscles. In dystrophic myotubes, the compound inhibited ROS production compared with control (untreated myotubes), attaining the same level of inhibition of our reference compound Diapocynin. Diapocynin is a semi-synthetic inhibitor of NADPH Oxidases that showed efficacy in dystrophic mouse modes and was used as positive control. The results obtained are therefore encouraging. On the other hand, GSK2795039 did not prevent force loss induced by eccentric contractions of dystrophic muscles. Due to the low number of muscles analyzed, further experiments will be needed to consolidate these results. In conclusion, the newly generated mouse models, N4(D)MC/(D)MC, and the selective targeting of NOXes using small molecule show the promise this target has in models of DMD. Further work is needed to elucidate its role in the pathophysiological cascade taking place in DMD.