Riassunto analitico
Bacterial cellulose is a biopolymer consisting of nanofibrillar structure which permits the production of various composite materials with improved characteristics. In addition, bacterial cellulose is non-toxic polymer that is inert to human metabolism, hence it’s very suitable for biomedical applications. Other important characteristics are its: pureness, high degree of polymerization, good crystallinity, good ability to retain water, good tensile strength, and “Generally Recognized As Safe” (GRAS) by the United States Food and Drug Administration. Bacterial cellulose production was described for different bacterial species, but the main producers are acetic acid bacteria and, amongst them, Komagataeibacter xylinus is considered one of the most relevant.
In this thesis, conducted in collaboration with the company Hylomorph AG, cellulose-producing acetic acid bacteria strains were examined as biocatalysts in combination with guided assembly-based biolithography (GAB) for production of a medical device made of surface microstructured bacterial cellulose. The medical device aims at reducing the formation of fibrotic tissue around implantable devices placed in soft tissues, thus decreasing the problems and health risks caused by the response reactions to foreign materials. The medical device is manufactured in the form of a pouch, synthesized by bacteria at the interface with a custom-made silicone bioreactor, which is surface-structured with GAB. So, upon bacterial fermentation, the nanofibers of the cellulose coating are assembled in a three-dimensional network.
This thesis aims to detect a Komagataeibacter species strain able to produce a medical device made of surface microstructured bacterial cellulose after a period of incubation inside the silicon surface-structured bioreactor, achieving a certain degree of control on directional alignment of individual nanofibers by GAB.
The first phase of the experimental work was focused on the screening of the 25 acetic acid bacteria strains from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) and Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), respectively. The screening was based on integrity of the pellicle formed during 7 days of static culture in a 100 ml Erlenmeyer flask and on the production yield. As an outcome of the screening process, 10 strains (5 from DSMZ and 5 from UMCC) were selected for further investigation.
In the next phase, each strain was cultivated in the elastomeric bioreactor supplied by Hylomorph AG. The cultivation process was carried out incubating the cultures in Hestrin–Schramm medium inside the aforementioned mold at 28 °C. The incubation time had been set at 7 days for each strain. The results were different depending on the strains used, which made it possible to optimize incubation time. Although positive results were obtained with almost all the strains used, at the end of the growth in the elastomeric molds, 5 strains were selected for further tests in order to elect the functionally most efficient one.
The determination of the successful creation of the network was assessed by scanning through an electron microscope using different voltages to observe different morphology of the mentioned network produced by different strains.
This thesis is the first step for the effective creation of the surface-microstructured bacterial cellulose device. Further analysis have to be run such as in vitro tests to prove the non-cytotoxicity of the device and, eventually, in model animal analysis to verified its durability, the reduction of fibrotic tissue build-up and inflammatory response to the material.
The surface-microstructured bacterial cellulose device, by reducing the formation of fibrotic tissue, may even facilitate revision surgery and reduce complications associated with device revision surgery such as infection.
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Abstract
La cellulosa batterica è un biopolimero costituito da strutture nanofibrillari, le quali consentono la produzione di vari materiali con caratteristiche migliorate. Inoltre, la cellulosa batterica è un polimero adatto ad applicazioni biomediche, essendo non tossico ed inerte al metabolismo umano. Altre caratteristiche importanti sono la sua purezza, l’alto grado di polimerizzazione, la buona cristallinità, la buona capacità di trattenere l'acqua, la buona resistenza alla trazione e il fatto che sia "Generally Recognized As Safe" dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. I principali produttori di cellulosa batterica sono i batteri acetici e, all’interno di questo gruppo, Komagataeibacter xylinus è considerato uno dei più rilevanti.
In questa tesi, condotta in collaborazione con la società Hylomorph AG, i ceppi di batteri acetici produttori di cellulosa sono stati esaminati come biocatalizzatori in combinazione con la GAB per la produzione di un dispositivo medico costituito da cellulosa batterica microstrutturata sulla superficie. Il dispositivo medico mira a ridurre la formazione di tessuto fibrotico attorno ai dispositivi impiantabili posizionati nei tessuti molli, riducendo così i problemi e i rischi per la salute causati dalle reazioni di risposta a materiali estranei. Il dispositivo medico è prodotto sotto forma di custodia, sintetizzata da batteri nell'interfaccia con uno stampo elastomerico su misura, composto in silicone strutturato in superficie mediante la GAB; grazie a ciò le nanofibre del rivestimento di cellulosa sono assemblate in un network tridimensionale.
Questa tesi mira a individuare un ceppo appartenente alla specie Komagataeibacter in grado di produrre un dispositivo medico realizzato in cellulosa batterica dopo un periodo di incubazione all'interno dello stampo in silicone, ottenendo un certo grado di controllo sull'allineamento direzionale delle nanofibre mediante il GAB.
La prima fase del lavoro sperimentale si è concentrata sullo screening dei 25 ceppi di batteri acetici provenienti dalla German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) e Unimore Microbial Culture Collection (UMCC). I parametri presi in considerazione come fattori cruciali durante la fase di screening sono stati: la resa di produzione e la produzione di un film di cellulosa unico. Al termine di questa fase sono stati selezionati 10 ceppi (5 di ogni collezione) per ulteriori indagini.
Nella fase successiva, ogni ceppo è stato coltivato all’interno dello stampo fornito da Hylomorph AG, in condizioni statiche, incubando a 28 °C le colture in terreno Hestrin–Schramm. Il tempo di incubazione era stato fissato a 7 giorni per ogni ceppo, ma successivamente ottimizzati data la varietà dei risultati. Sebbene siano stati ottenuti risultati positivi con quasi la totalità dei ceppi utilizzati, al termine della crescita negli stampi elastomerici, 5 ceppi sono stati selezionati per analisi più specifiche al fine di stabilire quale fosse quello funzionalmente più efficiente.
La determinazione dell’avvenuta creazione del network è stata valutata mediante scansione al microscopio elettronico sfruttando differenti voltaggi in modo tale da osservare diverse morfologie del network sopra menzionato, dovute alla produzione da parte di vari ceppi batterici.
Questa tesi è il primo passo per l'effettiva creazione del dispositivo di cellulosa batterica microstrutturata sulla superficie. Ulteriori analisi devono essere condotte come, ad esempio, prove in vitro per dimostrare la non citotossicità del dispositivo e, infine, analisi su animali modello per verificarne la durabilità e la riduzione dell'accumulo di tessuto fibrotico. Il dispositivo di cellulosa batterica potrebbe facilitare la chirurgia di revisione e, successivamente, ridurre le complicazioni, come ad esempio le infezioni, associate ad essa.
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