Riassunto analitico
Introduzione: La Timidilato Sintasi umana è un target convalidato per le terapie antitumorali.
Le classiche terapie antitumorali, basate sull’impiego di farmaci come i platino-derivati e i farmaci anti-TS, risultano essere inefficaci a causa dell’insorgenza di resistenza e di cross-drug resistenza. I farmaci attualmente in uso in terapia risultano privi di efficacia a causa dell’insorgenza del fenomeno di farmacoresistenza incrociata, pertanto, è sempre più ingente la necessità di sviluppare nuovi candidati farmaci presentanti un nuovo meccanismo d’azione nei riguardi dell’enzima target, capaci di inibirne l’attività catalitica e ridurne i livelli di espressione proteica. Gli inibitori dissociativi sono una classe di composti aventi come target l’interazione proteina-proteina. Lo studio del meccanismo d’azione molecolare di tale classe di molecole risulta essere alquanto complesso, poiché richiede l’impiego di modelli di interazione farmaco-recettore più o meno complessi. Scopo: Lo scopo del mio lavoro di tesi sperimentale (progetto AIRC - IG16779) consiste nel caratterizzare il profilo di inibizione di un pannello di composti selezionati, agenti a livello dell’interfaccia del target e destabilizzanti la conformazione dimerica, spostando l’equilibrio dimero-monomero a favore di quest’ultimo. Per raggiungere tale scopo, mi sono occupata di: 1- purificare e caratterizzare la proteina hTSwt e le sue isoforme mutanti selezionate; 2- saggiare l’efficacia inibitoria (IC50) dei composti selezionati; 3- coniugare il pannello di proteine con sonde fluorescenti al fine di valutare la potenza dissociativa dei composti selezionati; 4- allestire e applicare la tecnica del BN-Page (Blue Native elettrophoresis) per visualizzare, in condizioni native, l’effetto dissociativo dei composti migliori selezionati; 5- valutare la costante di dissociazione di tali composti; 6- analizzare i dati. Discussione e risultati: Sei isoforme mutate dell’enzima hTS, presentanti singole mutazioni puntiformi a livello dell’interfaccia monomero-monomero, sono state selezionate e purificate. Ognuna di esse è stata caratterizzata dal punto di vista cinetico, mostrando evidenti variazioni sia in termini di affinità di binding per le molecole substrato, che in termini di attività catalitica rispetto all’isoforma wild-type. Un set di 15 composti è stato selezionato e saggiato mediante saggio colorimetrico nei confronti dell’intero pannello di proteine. Analizzando i dati ottenuti, è stato possibile selezionare alcuni ligandi, capaci di inibire in maniera differenziale il profilo di attività cinetica delle isoforme mutate rispetto alla wild type, confermando così il ruolo dei residui mutati nel binding mode di tali composti a livello dell’interfaccia monomero-monomero. L’efficacia dissociativa è stata inoltre valutata mediante saggio fluorimetrico (FRET), dimostrando così la capacità del set di composti selezionato nel perturbare la stabilità della conformazione dimerica. Tali dati sono stati confermati attraverso un saggio di elettroforesi nativa, dimostrando così l’effettivo meccanismo dissociativo di tale classe di molecole. Conclusioni: Il lavoro svolto ha permesso di caratterizzare l’equilibrio monomero-dimero della proteina hTS in presenza di specifici inibitori in grado di destabilizzare la conformazione dimerica con un nuovo meccanismo d’azione non ancora del tutto definito. A supporto di ciò, sarà necessario estendere il numero delle isoforme proteiche mutate e ampliare lo spazio chimico delle molecole saggiate, in modo da comprendere la relazione struttura-attività e migliorarne il profilo di sicurezza ed efficacia nell’ottica del loro potenziale sviluppo farmaceutico.
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Abstract
Introduction: The human Thymidylate Synthase (hTS) is a known target for anti-cancer therapy. The classical anti-cancer therapies based on different drugs such as platinum-derived drugs or anti-TS drugs may result ineffective because of resistance and cross-drug resistance development. The drug resistance effect is shown by the increased hTS level and, sometimes, TSmRNA levels. Nowadays, it is increasingly necessary to develop new drugs showing a new mechanism of action on the target protein for inhibiting its kinetic activity and reducing its expression levels. Dissociative inhibitors are specifically a class of compounds that target the protein-protein interaction endeavour and can trigger the described mechanism. Designing such compounds requires a special effort to study the molecular mechanism of action using simplified or engineered models of the drug-target interaction event. Aim of the work: The aim of my research work (AIRC project - IG16779) consists of characterizing the inhibition profile of a selected compounds panel acting at the monomer-monomer interface of the target enzyme, able to induce a perturbation of the protein’s dimeric conformation with a consequent shifting of the dimer-monomer equilibrium towards the monomeric form. In order to achieve this aim, I performed the following activities: 1– purification of hTS wild type and selected mutant isoforms, and characterization of their kinetic activity profile; 2– inhibition assay by IC50 values determination for studying the inhibitory efficacy profile on the mutants respect to wild type isoform of the selected compounds set; 3- conjugation of the purified proteins with fluorescent probes pair and FRET assay for evaluating the dissociative potency of the compounds panel on the target proteins; 4– set up and application of the BN-Page (blue native gel electrophoresis) technique on the target hTS to directly visualize the dissociative potency of the best selected dimer-disrupters in native electrophoresis gel; 5– Kd evaluation of the most interesting compounds; 6– Data analysis. Discussion and Results: Six mutant isoforms of hTS enzyme carrying single-point mutations (hot-spot) at the monomer-monomer interface of the hTS enzyme have been selected and purified. Each of them was characterized by kinetic point of view, showing evident variations in terms of substrate binding affinity and kinetic activity respect to wild type. A selected compound set, including 15 molecules, was spectrophotometrically assayed on the hTS proteins panel. Analysing the data, it was possible to select some compounds characterized by a marked variation in terms of potency inhibition between mutant isoforms and wild type, so underlining the importance of that single point residue in the binding affinity at the monomer-monomer interface. The dissociative efficacy of the same compounds library was also evaluated by FRET assay, demonstrating that the selected compounds are able to perturbate the dimer stability of the mutants with a comparable efficacy to the wild type. The dissociative efficacy of the most interesting compounds was also evaluated in a native electrophoretic assay and by Kd values evaluation, that demonstrates the effective capability of these compounds to shift the dimer-monomer equilibrium towards this latter. Conclusion. During my thesis work I was able to characterize the equilibrium monomer-dimer of hTS in presence of specific inhibitors able to destabilize the dimer stability with a new mechanism that is still not completely clarified. The obtained set of mutants at the monomer surface, will be tested against the inhibitors panel to identify structure-activity relationships. The SAR information combined with future molecular modelling studies will guide the design of novel dissociative inhibitors.
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