Riassunto analitico
Le Gonadotropine sono ormoni comunemente utilizzati come farmaci nei protocolli di iperstimolazione ovarica che precedono la fecondazione in vitro così da aumentare il numero dei follicoli ovarici maturi.
I farmaci gonadotropinici di ultima generazione impiegano molecole ricombinanti in modo da migliorare le caratteristiche degli ormoni, inizialmente purificati direttamente da uomo, così da perfezionare la terapia farmacologica. Tra questi farmaci, due delle gonadotropine più utilizzate sono Corifollitropina alfa e l’ormone follicolo stimolante ricombinante (rhFSH).
Questi due ormoni agiscono col medesimo meccanismo d’azione sullo stesso tipo di recettore (FSHR) posto sulla membrana delle cellule della granulosa, ma con profili farmacocinetici differenti. Il recettore FSHR appartiene alla famiglia dei recettori associati alle G proteine e, quando viene attivato dal legame con le gonadotropine, innesca una cascata enzimatica intracellulare che porta, attraverso l’aumento della concentrazione del secondo messaggero AMP-ciclico (cAMP), a cambiamenti nella regolazione della trascrizione genica. È inoltre noto che ligandi differenti, pur agendo su uno stesso tipo recettoriale, sono in grado di modulare diversamente la regolazione genica.
L’obiettivo di questa tesi è individuare eventuali analogie o differenze nella regolazione genica generate da dosaggi bioequivalenti di due differenti gonadotropine (corifollitropina alfa e rhFSH) in un sistema di colture primarie di cellule della granulosa (hGCs) in vitro.
Individuare geni che risultino essere differenzialmente espressi a seguito dei trattamenti ormonali in hGCs, di cui è ben nota una comunicazione paracrina con l’oocita durante il processo di maturazione follicolare, potrebbe portare alla scoperta di nuovi geni marker da impiegare nella valutazione della qualità ovocitaria.
La prima fase della mia ricerca è stata dedicata all’individuazione dei dosaggi bioequivalenti dei due ormoni in hGCs da pazienti anonime (previo consenso informato). Le cellule, purificate dall’aspirato follicolare, sono state messe in coltura per sei giorni e sincronizzate per 24 h prima del trattamento ormonale. Sono stati fatti studi time course e dose risposta per entrambi i farmaci ed è stata valutata la produzione di cAMP intracellulare a seguito dei diversi trattamenti con il kit Detect Cyclic AMP Enzyme Immunoassay Kit (Arbor Assays, MI, USA).
In base ai risultati ottenuti si è stabilito come dosaggio bioequivalente: [cAMP]intracellulare prodotto da 875 µg/µL di corifollitropina alfa=[cAMP]intracellulare prodotto da 1ng/µL di rhFSH a 30’ di incubazione.
È stato estratto l’RNA totale dalle cellule cosi trattate attraverso purificazione in colonna (RNeasy® Mini Kit, Qiagen, Germany) e trattamento con Dnasi I. L’RNA è stato controllato mediante spettrofotometria (NanoDrop, Thermo Fisher, MD, USA) per stabilire grado di purezza e concentrazione.
Circa 200 ng di RNA totale sono stati retrotrascritti e il cDNA risultante è stato impiegato come templato in reazioni di RT-qPCR per verificare la classica attivazione degli enzimi steroidogenici (p450scc e aromatasi CYP19A1).
Una volta passati tutti i controlli, circa 400 ng del restante RNA totale, derivante da ogni singolo campione, è stato conservato e preparato per analisi, attraverso l’uso di microarrays (Clariom™ D assays, human, Affymetrix, USA), della regolazione di circa 30000 singoli geni e delle loro rispettive famiglie geniche allo scopo di individuare nuovi candidati gene marker per la qualità ovarica
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