Riassunto analitico
L’epidermide si rinnova continuamente tramite l’attivazione dei cheratinociti staminali (KSCs) e un corretto equilibrio tra la proliferazione e il differenziamento dei progenitori ad amplificazione transiente (TACs), originati dalle stesse KSCs.
Negli ultimi trent’anni, è stato consolidato un metodo per la coltivazione e l’espansione dei cheratinociti umani, ampiamente usato in modelli di malattia, ricerca di farmaci e medicina rigenerativa. Le colture autologhe di cheratinociti umani possono generare lembi di epitelio finalizzati al trattamento di ustioni massive a tutto spessore, ustioni di occhi con perdita di cellule staminali limbari, o ancora, approcci di terapia genica ex vivo per gravi malattie della pelle, come ad esempio l’Epidermolisi Bullosa.
In tutti questi casi, è richiesto un corretto quantitativo di KSCs per permettere la rigenerazione permanente e funzionale dell’epitelio. I cheratinociti clonogenici possono essere analizzati al livello clonale. I KSCs danno luogo a Olocloni (H), mentre le TACs danno luogo a Merocloni (M) e Paracloni (P).
Il mio progetto si focalizza sulla caratterizzazione molecolare degli H vs M per studiare uno strumento che permetta di identificare più facilmente ed eventualmente isolare una popolazione pura di cellule staminali per applicazioni in medicina rigenerativa
Abbiamo allestito analisi clonali a partire da differenti culture primarie di epidermide, isolando l’RNA da Olocloni, Merocloni e Paracloni per poter effettuare poi un analisi di microarray.
L’analisi bioinformatica dei dati di microarray ha portato a identificare geni differenzialmente espressi e ci ha permesso di delineare un profilo molecolare per ogni classe di clone. Infatti, i dati sono stati analizzati tramite il softwere Ingenuity® Pathway Analysis per identificare le vie di segnale e le funzioni differenzialmente espresse nei differenti tipi di cloni.
Alcuni geni identificati in seguito all’analisi dei microarray sono stati validati al livello di RNA, tramite real time PCR quantitativa.
A seguito di un analisi di Gene Onthology abbiamo concluso che negli olocloni sono overespressi i geni coinvolti nel riparo del DNA, checkpoint control, mitosi e ricombinazione omologa; sono invece down-regolati igeni connessi all’apoptosi, alla mobilità cellulare e al danno al DNA.
Tra tutti i geni ottenuti, ci siamo focalizzati sul fattore trascrizionale FOXM1. FOXM1 è coinvolto nella promozione di tumori, nella transizione G1/S, nella progressione in fase S e nella transizione G2/M, nella migrazione cellulare e nell’assemblamento del cinetocoro. In particolare, è stato visto che FOXM1 è in grado di regolare altre cellule somatiche come ad esempio le staminali ematopoietiche.
Analisi di western blot, real time PCR e immunofluorescenza hanno confermato che FOXM1 è overespresso negli H vs M, a supporto dei risultati ottenuti dai dati bioinformatici.
Per investigare il ruolo di FOXM1 abbiamo modulato la sua espressione in colture primarie di cheratinociti. Questi esperimenti rivelano che FOXM1 regola la clonogenicità dei cheratinociti e i livelli di espressione di marcatori staminali come ad es. p63 e survivina. Inoltre abbiamo riscontrato che i livelli proteici di FOXM1 dipendono dall’attività trascrizionale di YAP, un noto regolatore di KSCs, a conferma del ruolo di FOXM1 nel mantenimento della staminalità.
In conclusione, questi dati dimostrano che l’Oloclone ha un profilo genico specifico che permette di distinguere formalmente i cheratinociti staminali dalle TACs. Inoltre, la comprensione del ruolo di FOXM1 nel mantenimento dei KSCs migliorerà la possibilità di identificarli in coltura e conseguentemente le loro applicazioni in medicina rigenerativa.
|
Abstract
The epidermis is continuously renewed through the activation of Keratinocytes Stem cells (KSCs) and a correct balance between multiplication and differentiation of Transient Amplifying progenitors (TACs) originated from the KSC.
In the last thirty years, a method for cultivating and expanding human keratinocytes has been consolidated and widely used in disease modelling, drug discovery and regenerative medicine. Autologous cultures of human keratinocytes generate epithelial grafts used for treatment of massive full-thickness skin burns, chemical burn-dependent ocular burns with limbal stem-cell deficiency, or ex-vivo gene therapy approaches for severe genetic skin diseases, such as Epidermolysis Bullosa. In all these cases, a correct amount of KSC is required in order to permanently regenerate a functional epithelium. Clonogenic keratinocytes can be analysed at clonal level. KSCs gives rise to Holoclones (H), whilst TACs gives rise to Meroclones (M) and Paraclones (P). My project focused on the molecular characterization of Holoclones vs Meroclones in order to study useful tools to easily identify and eventually isolate a pure population of stem cells for regenerative medicine application.
We carry out a clonal analysis on different strains of epidermis, in order to isolate RNA from Holoclones, Meroclones and Paraclones to perform a microarray analysis. Bioinformatical analysis of microarray data allowed to identify differentially expressed genes and delineated a molecular signature of each class of clones. Data were analyzed by the network-based Ingenuity pathway analysis tool to search for the most relevant pathways and functions differentially expressed in the different clonal types.
Targets identified by microarray data were validated at RNA level, with quantitative real time PCR.
After Gene Ontology analysis we found that Holoclones have a characteristic profile: genes involved in DNA repair, checkpoint control, mitosis and homologous recombination are upregulated, and genes linked to apoptosis, cell movement and DNA damage are downregulated.
Among all the genes obtained, we focused on the transcription factor FOXM1. FOXM1 plays a role in cancer promotion, indeed it is involved in G1/S transition, S progression and in G2/M transition, in cell migration and kinetochore assembly. Of note, FOXM1 has been shown to regulate other somatic stem cells, such as hematopoietic stem cells.
Western blot, real time PCR and immunofluorescence analysis confirmed that FOXM1 is upregulated in H vs M, supporting the results obtained with bioinformatics data.
To investigate the role of FOXM1 in cultured primary keratinocytes we modulated its expression with loss and gain of function experiments. These experiments reveal that FOXM1 affects keratinocytes clonogenicity and expression level of stemness markers, such as p63 and survivin. Moreover we found that FOXM1 protein levels depend on the transcriptional activity of YAP, a known regulator of KSCs, confirming the role of FOXM1 in stemness maintenance.
In conclusion, these data demonstrate that Holoclone has a specific gene signature that permits to formally distinguish the Keratinocytes Stem cells from Transient Amplifying cells. In addition understanding the role of FOXM1 in KSC maintenance will improve the possibility to identify KSC in culture for regenerative medicine applications.
|
