Riassunto analitico
La distrofia muscolare facio-scapolo-omerale (FSHD) è una miopatia ereditaria con una prevalenza di 1 a 15-20.000 individui, caratterizzata da progressiva debolezza dei muscoli del viso, delle spalle, e della parte superiore delle braccia. FSHD è una malattia geneticamente eterogenea che coinvolge sia alterazioni genetiche che epigenetiche. Si osserva nella maggior parte dei casi FSHD (> 95%) una delezione parziale monoallelica delle sequenze ripetute D4Z4 in corrispondenza della zona subtelomerica del cromosoma 4q. Sono stati proposti molti modelli che spiegano l'insorgenza di FSHD, ma un modello unico è ancora mancante. In tutti i modelli proposti le modifiche della cromatina così come la metilazione del DNA o le modifiche istoniche sono usati come un ulteriore livello di complessità che potrebbe aiutare ad interpretare la complessa correlazione tra genotipo e fenotipo nella FSHD. Un lavoro precedentemente condotto nel laboratorio Miogen (Salani M. e R. Tupler inedito) su cellule Hela mostra che i due geni più vicini alla porzione D4Z4, il gene codificante per la proteina FRG2 e il gene per l’RNA non codificante DBE, sono sottoposti a silenziamento reversibile. Questo silenziamento sembra essere mediato dalla cromatina, in quanto gli inibitori delle istone deacetilasi inducono la loro selettiva derepressione. Istone deacetilasi (HDAC) 4 e 5, che sono noti regolatori della miogenesi scheletrica, sono reclutati sulle ripetizioni D4Z4. L’espressione dei FRG2 è sensibile anche ad altri agenti che alterano cromatina: è specificamente indotto dalla inibizione della PolyADP-Ribosio Polymerase (PARP), ed anche in seguito a trattamento con agenti genotossici come etoposide e H2O2. Il lavoro di Salani M. ha stabilito che il silenziamento di FRG2 nella regione prossimale a D4Z4 è mediato dal reclutamento di HDAC 3, 4, 5 e PARP1. Il reclutamento di PARP1 e HDAC 4 e 5 sull'array D4Z4 fornisce fattori in grado di rispondere agli stimoli esterni come trattamenti farmacologici o meccanismi di segnalazione intrinseci come il differenziamento miogenico. Lo scopo del mio lavoro nel laboratorio Miogen è stato la creazione di un modello di coltura cellulare di FSHD dove misurare la risposta ad agenti genotossici e verificare se l'induzione di FRG2, DBE e geni correlati a regione 4q35 potrebbe compromettere il differenziamento muscolare. Per fare ciò ho utilizzato un vettore adenovirale per indurre l'espressione di MyoD nei fibroblastI. L’infezione del vettore induce l’espressione di MyoD e ciò permette ai fibroblasti di essere riprogrammati in mioblasti. Quando coltivati in mezzo contenente il 2% di siero di cavallo, i mioblasti differenziano in miotubi entro 48-72 ore. Abbiamo valutato il processo di differenziamento dei fibroblasti ottenuti da 3 individui sani e 3 pazienti FSHD, a più intervalli, e abbiamo analizzato il processo differenziativo e la sensibilità delle diverse linee ad agenti genotossici. I nostri risultati mostrano che entrambi i tipi di fibroblasti possono riprogrammare in mioblasti e differenziarsi in miotubi multi-nucleati. Abbiamo dimostrato che l'espressione di diversi geni del differenziamento è in ritardo nelle cellule FSHD rispetto alle cellule controllo. Inoltre il danno al DNA induce l'espressione di geni correlati alla regione 4q35. Abbiamo testato la capacità di recupero delle cellule in seguito al danno del DNA nelle cellule controllo e in quelle FSHD. In conclusione, abbiamo postulato che le anomalie descritte nei nostri esperimenti di differenziamento potrebbero essere responsabili della debolezza muscolare osservata nei pazienti affetti da FSHD.
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Abstract
Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is a hereditary myopathy with a prevalence of 1 in 15-20,000 individuals, characterized by progressive wasting of facial, shoulder, and upper arm musculature. FSHD is a genetically heterogeneous disorder which involves both genetic and epigenetic alterations. A monoallelic partial deletion of D4Z4 repeat sequences at the subtelomeric region of chromosome 4q is observed in the majority of FSHD cases (>95%). Many models explaining the onset of FSHD were proposed, but a unifying model is still missing. In all the proposed models chromatin modifications such as DNA methylation or histone modifications are used as an additional layer of complexity that might help interpreting the complex correlation between genotype and phenotype in FSHD.
Previous work in the Miogen lab (Salani M. and Tupler R. unpublished) conducted on Hela cell line shows that the two most D4Z4-proximal genes, the protein-coding gene FRG2 and the non-coding regulatory RNA DBE, are subjected to reversible silencing. This silencing appears to be chromatin-mediated, because histone deacetylase inhibitors induced their selective derepression. Histone deacetylases (HDACs) 4 and 5, which are known regulators of skeletal myogenesis are recruited to D4Z4 repeats. Expression of FRG2 is also sensitive to other agents that alter chromatin: it is specifically induced following inhibition of PolyADP-Ribose Polymerase (PARP), and also by treatment with genotoxic agents such as etoposide and H2O2. Collectively, the work of Salani M. has established that silencing of the D4Z4-proximal FRG2 is mediated by recruitment of HDAC 3, 4, 5 as well as PARP1. The recruitment of PARP1 and HDACs 4 and 5 to the D4Z4 array provides factors capable of responding to external stimuli such as drug treatments or intrinsic signaling mechanisms such as myogenic differentiation.
The aim of my work in Miogen lab has been the establishment of a cell culture model of FSHD where to measure the response to genotoxic agents and test whether the induction of FRG2, DBE and genes related to region 4q35 could impair muscle differentiation. Using an adenoviral vector to induce the expression of MyoD, fibroblasts are reprogrammed into myoblasts. When cultivated in 2% horse serum containing medium, myoblasts differentiate to myotubes within 48-72 hours.
We evaluated the differentiation process of the fibroblasts obtained from 3 healthy individuals and 3 FSHD patients at various time points and analyzed the differentiation potential and progression and the susceptibility of the different lines to genotoxic agents.
Our results show that both types of fibroblasts can reprogram to myoblasts and differentiate into multi-nucleated myotubes. We demonstrate that the expression of several differentiation genes is delayed in FSHD cells as compared to control cells. Moreover DNA damage induces the expression of genes related to region 4q35. We test the recovery of control and FSHD cell lines from DNA damage stress. In conclusion, we postulate that the abnormalities outlined in our differentiation experiments could be responsible for muscle weakness in patients with FSHD.
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