Riassunto analitico
Dall'analisi della letteratura emerge con forza l’esigenza di trovare un sistema di coltura per cellule epiteliali del sistema respiratorio umano che consenta al contempo il mantenimento sia del potenziale proliferativo cellulare a lungo termine che della potenzialità differenziativa. Tale esigenza scaturisce da più ambiti d’investigazione: ricerche di base volte allo studio dei processi omeostatici e differenziativi sottesi alla fisiologia del tessuto epiteliale respiratorio; studi incentrati sulle risposte dell’epitelio respiratorio a stress ambientali quali il fumo di sigaretta; studi volti allo screening di farmaci per patologie croniche ostruttive, asma, tumori dell’epitelio respiratorio; per finire, nuove strategie terapeutiche per patologie genetiche quali la fibrosi cistica. Inoltre, anche nell’ambito della medicina traslazionale alcune esperienze cliniche recenti hanno messo in evidenza la possibilità di realizzare trapianti di regioni dell’albero respiratorio, attraverso approcci d’ingegneria tissutale, in pazienti affetti da stadi terminali di tumore primario alla trachea. L’analisi a lungo termine dei pazienti trattati ha evidenziato l’importanza d’avere un epitelio integro e capace d’auto-rinnovarsi sulla trachea umana ricellularizzata al fine di prevenire infezioni, reazioni fibrotiche e stenosi nell’area trapiantata. Tali caratteristiche si possono ottenere solo se le condizioni d’espansione cellulare sono permissive per il mantenimento di un adeguato numero di cellule staminali. L’obiettivo di questo studio è stato dunque quello di verificare diverse funzioni delle cellule epiteliali tracheali umane coltivate in un sistema di coltura precedentemente utilizzato per colture epiteliali di altri distretti corporei ad oggi applicate in terapia sull’uomo. A tale fine, abbiamo analizzato tramite immunofluorescenza l’espressione di differenti marcatori tipici del tessuto tracheale in sezioni di trachea umana in vivo, quindi si è proceduto all’isolamento di cellule epiteliali tracheali da biopsia di cadavere. Tali cellule sono state coltivate su feeder layer irradiato in presenza di siero fetale bovino, in passaggi seriali fino alla senescenza replicativa. In tal modo si è valutata la velocità di crescita, la resa cellulare, la capacità di formare colonie di tessuto organizzato ed il potenziale proliferativo misurato come numero totale di duplicazioni cellulari prima del raggiungimento della senescenza. Successivamente abbiamo proceduto all’analisi d’espressione di marcatori sia tipici della popolazione staminale/progenitrice, che marcatori tipici del differenziamento, della proliferazione e basali delle cellule epiteliali tracheali umane durante i passaggi seriali della lifespan, tramite western blot ed immunofluorescenza. Per valutare accuratamente il potenziale differenziativo delle cellule epiteliali tracheali sono state realizzate colture in airlift, nelle quali i cheratinociti cono stati seminati su connettivo umano ed emersi fino a completa stratificazione a contatto diretto con l’aria. Parallelamente sono stati realizzati diversi protocolli di decellularizzazione su trachea porcina per ottenere una completa rimozione delle cellule tracheali del donatore, mantenendo l’architettura della matrice dell’organo, pronta per la ricolonizzazione con i cheratinociti umani espansi in vitro. Concludendo è possibile affermare che le condizioni di coltura verificate, permettono il mantenimento del potenziale proliferativo e differenziativo delle cellule tracheali umane a lungo temine, costituendo dunque un valido modello di coltura cellulare sfruttabile in molti ambiti investigativi. Fra questi ultimi la possibilità di utilizzare tale sistema di coltura per ottenere un’appropriata ricellularizzazione di scaffold biologici o sintetici utilizzati per la realizzazione di trachee autologhe bioingnerizzate per il trattamento di pazienti in condizioni gravissime.
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