Riassunto analitico
Il carcinoma ovarico (OC) è l’ottavo cancro più comune e la quinta causa di morte su base tumorale nelle donne, nelle quali causa il maggior numero di morti rispetto ad ogni altro tumore del sistema riproduttivo femminile. Se scoperto nelle fasi precoci dello sviluppo tumorale, le risposte da parte delle pazienti sono buone e il trattamento standard, che prevede una citoriduzione chirurgica seguita da un trattamento farmacologico di paclitaxel e cisplatino-derivati, è efficace. Sebbene la risposta primaria a questo tipo di trattamento sia alta, la percentuale di ricaduta è altrettanto alta ed è frequente l’instaurarsi del fenomeno della farmaco resistenza, le cui basi biologiche non sono ancora ben definite. È stato però chiarito che, tra gli eventi cellulari in essa coinvolti, ci sia l’over-espressione di un enzima chiave per la sintesi dei precursori del DNA e coinvolto nel ciclo dei folati, la timidilato sintasi (TS). Questo enzima catalizza la metilazione riduttiva della 2’-deossiuridina -5’-monofosfato (dUMP) in timidina-5’-monofosfato (dTMP). Inoltre, TS, nella sua forma monomerica, è coinvolta in un meccanismo di regolazione a feedback attraverso il legame al suo mRNA.
Recentemente è stata identificata e sintetizzata una nuova classe di inibitori della TS umana. Si tratta di peptidi che, attraverso un meccanismo allosterico, si legano all’interfaccia del dimero della proteina senza causarne l’over-espressione e andando a stabilizzare la forma inattiva.
In particolare, LR è un ottapeptide con dimostrata azione citotossica verso la linea cellulare di cancro ovarico A2780. Il primo passo nello studio degli effetti cellulari indotti dal trattamento con questo peptide è stato quello di analizzare il proteoma di cellule A2780 attraverso un approccio semi-quantitativo basato sulla spettrometria di massa (MS). Utilizzando un approccio bioinformatico è stato poi possibile interpretare i dati ottenuti e integrare le proteine coinvolte e i pathways identificati con le proteine a bassa abbondanza non visibili alla massa. In particolare, sono state integrate le proteine del cammino metabolico dei folati, in quanto sono target noti del nostro candidato farmaco.
Dall’integrazione dei dati di massa con l’analisi bioinformatica è stato così ottenuto un pannello di proteine differenzialmente espresse dal trattamento con LR in cellule A2780.
La modulazione di 10 tra queste proteine è stata validata attraverso saggi di western blot. L’analisi è stata poi ampliata ad un analogo del peptide, [D-Gln4]LR, e ad un farmaco multi target antifolato, il Pemetrexed (PMX, Alimta™), per confrontare l’effetto dei nostri peptidi rispetto ad un farmaco noto. Le validazioni sono state inoltre estese ad altre due linee cellulari di carcinoma ovarico, IGROV-1 e A2780CP.
In conclusione, lo scopo del mio lavoro di tesi sperimentale è stato quello di studiare gli effetti di LR e del suo analogo attraverso uno studio di proteomica label-free a livello cellulare e definire,s in diverse linee cellulari di cancro ovarico, un pannello di proteine modulate da entrambi i trattamenti.
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Abstract
Ovarian cancer (OC) is the eighth most common cancer and the fifth leading cause of cancer death. The crude incidence of this cancer is 18 and increase with age, the mortality is 12/100000 woman/year. OC causes more deaths than any other cancer of the female reproductive system, but it accounts for only about 3% of all cancers in women. When ovarian cancer is found in its early stages, treatment is most effective. The standard treatment of OC consists of a combination of paclitaxel and cisplatin derivatives after primary surgery as the most common surgical cytoreduction. Although the initial response rate is high, this treatment often gives rise to drug resistance, a phenomenon whose molecular bases are not yet fully elucidated. However, there is evidence that the process includes over-expression of Thymidylate Synthase (TS), a key enzyme involved in a complex pathway, folate cycle and in a key step in DNA biosynthesis to catalyze the reductive methylation of 2‘-deoxyuridine -5’-monophosphate (dUMP) to thymidine-5’-monophosphate (dTMP). Furthermore TS is implicated in feedback regulation with its mRNA.
Recently, a new class of peptidic inhibitors of TS has been identified and synthesized, showing an allosteric mechanism to inhibiting thymidylate synthase, without causing its feedback over-expression. Peptide binds the enzyme interface and stabilizes the inactive dimeric form.
In particular, the octapeptide LR showed high cytotoxicity versus ovarian cancer cell lines, A2780.
A mass-spectrometry (MS) based semi-quantitative approach of the cellular proteome of A2780 was the starting point to determine the proteins modulated by the treatment with the peptide; the global interpretation of data obtained was driven by bioinformatics, through the integration of the interaction data from public domain repositories in conjunction with pathway and molecular function annotation. The modulated pathways by treatment with LR peptides was integrated by bioinformatics approach with proteins involved in folate pathway, which contains low level expression proteins, not detectable by mass spectrometry.
The protein profile set obtained was validated by western blot on epithelial ovarian cancer cell lines A2780 which showed a sensibility towards LR peptide, monitoring also treatments with a more effective LR analogue, [D-Gln4]LR, for validation purposes, and with a multitarget anti-folate drug, Pemetrexed (PMX, Alimta™), with the aim of evaluating its behavior compared to our peptides. Each validation was extended to other two ovarian cancer cell lines, IGROV1 and A2780CP.
In conclusion, the aim of my work is to study the effect of LR and LR analogue, [D-Gln4]LR by a label-free proteomics at the cellular level and define a protein set modulated by both peptides that could be informative and predictive of the peptide activity in several ovarian cancer cells.
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