Riassunto analitico
In seguito ad un’infezione sistemica le cellule del sistema immunitario producono numerosi mediatori solubili tra cui le principali citochine pro-infiammatorie. Queste molecole possono agire a livello del cervello generando un insieme di sintomi che determinano una condizione di malattia caratterizzata da numerose alterazioni molecolari e comportamentali. Quando questa risposta persiste nel tempo, come nel caso di infezioni sistemiche, cancro o malattie autoimmuni, l’invio di segnali al cervello è intensificato fino a determinare lo sviluppo di sintomi depressivo simili in soggetti vulnerabili. La conoscenza dei meccanismi genetico-molecolari responsabili di questi processi è ancora parziale. Negli ultimi anni sempre più numerose e importanti sono state le ricerche che hanno dimostrato come modificazioni epigenetiche a carico del DNA e delle proteine istoniche rappresentino i meccanismi attraverso i quali le cellule del SNC possono adattare la loro risposta trascrizionale a stimoli ambientali di varia natura compresi lo stress e gli stimoli immunitari. Sulla base di queste premesse, lo scopo principale del nostro studio è stato quello di approfondire i meccanismi molecolari attivati dall'infiammazione e responsabili di importanti modificazioni nella fisiopatologia del SNC. Nello specifico, abbiamo valutato i livelli di fosforilazione in Ser-10 e acetilazione in Lys-14 dell’istone H3 (H3S10p-K14ac) in ratti in cui è stato indotto uno stato infiammatorio mediante l’iniezione i.p. di Lipopolisaccaride (LPS) a 2 e 6 ore. Mediante Western Blot abbiamo dimostrato che nella frazione nucleare di alcune aree cerebrali, quali l'ippocampo e l'ipotalamo, la somministrazione sistemica di LPS provoca un aumento significativo di H3S10p-K14ac. Questo aumento compare a 2 ore e viene conservato a 6 ore dal trattamento. Tali modificazioni istoniche sono, inoltre, accompagnate da importanti aumenti nell'attività trascrizionale. In particolare, mediante real time PCR, è stato osservato che LPS induce l'espressione di numerosi geni tra cui alcune citochine pro-infiammatorie, l'oncogene cFos e la ossido nitrico sintetasi inducibile. Questi risultati ci hanno fatto ipotizzare che H3S10p-K14ac potesse controllare direttamente e specificamente la trascrizione di tali geni aumentando l'attività trascrizionale sui loro promotori. Per dimostrare, o confutare, questo ci siamo avvalsi della tecnica dell'immuno-precipitazione di cromatina (ChIP). Grazie a questa e all’utilizzo di primer contro le sequenze nei promotori dei geni in esame, è stato possibile dimostrare che, per alcuni di questi, l'aumentata trascrizione è conseguenza degli aumenti di H3S10p-K14ac indotti da LPS. Nelle stesse condizioni sperimentali abbiamo valutato la localizzazione e lo stato di attivazione di alcuni fattori di trascrizione, quali CREB e NF-κB, che, in cooperazione con gli aumenti di H3S10p-K14ac, possono promuovere la trascrizione genica. Inoltre, i livelli di H3S10p-K14ac sono stati misurati mediante analisi immunocitochimica. Questa tecnica ha permesso di dimostrare che gli aumenti della modificazione istonica riguardano diverse popolazioni cellulari sia neuronali che gliali con differenze nelle aree esaminate. Per meglio discriminare l'azione di LPS sulle diverse popolazioni cellulari abbiamo utilizzato alcuni modelli in vitro. In particolare, un modello di microglia immortalizzata, la linea cellulare BV-2, che ci ha permesso di dimostrare come questa risponda all'esposizione alla tossina batterica attivando la H3S10p-K14ac e, di conseguenza, la trascrizione di molti dei geni up-regolati in vivo. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che alcuni stimoli ambientali agiscono su diverse aree cerebrali determinando importanti cambiamenti nei livelli di H3S10p-K14ac e, di conseguenza, una maggiore accessibilità di alcuni promotori al legame con specifici fattori di trascrizione con induzione trascrizionale di alcuni geni.
|
Abstract
Epigenetic modifications of both DNA and histone proteins are now emerging as fundamental mechanisms by which neurons adapt their transcriptional response to environmental cues, such as, immune stimuli or stress. Genetic polymorphisms in a large number of genes quantitatively and qualitatively affect immune and inflammatory responses, altering the susceptibility to or course of a large number of CNS diseases with an inflammatory component. A peripheral infection induces innate immune cells to produce pro-inflammatory cytokines acting on the brain causing sickness behavior. Persistent activation of the peripheral immune system, such as during systemic infection, cancer or autoimmune diseases, causes immune signaling to the brain that can lead to an exacerbation of sickness and the subsequent development of symptoms of depression in vulnerable individuals. Furthermore, modification of histone status is known to regulate the transcription of specific genes involved in inflammatory conditions. Given this, the purpose of our study was to better understand the molecular mechanisms underlying neural-immune interaction in sickness behavior in CNS at the chromatin level.
More specifically, we investigated modifications in histone H3 phosphorylation at serine10 and acetylation at lysine14 (H3S10p-K14ac) in a CNS inflammatory condition, induced by an i.p. injection with Lipopolysaccharide (LPS) in rats to 2 h and 6 h after exposure to LPS.
Western blot analysis showed a substantial increase the modification of H3S10p-K14ac after 2 h in the nuclear fraction of some cerebral areas which was maintained up to 6h.
The changes in histone H3 phosphoacetylation were also accompanied by marked transcriptional activity induced by LPS, particularly in the expression of pro-inflammatory cytokines and the immediate early gene c-Fos. We hypothesized that H3S10p-K14ac is a chromatin remodeling mechanism that mediated the LPS transcriptional activity and it selectively turned on the transcription of specific gene promoters. To test this hypothesis, we performed chromatin immuno-precipitation analysis (ChIP) and we showed that the activation of promoter transcription, mediated by H3S10p-K14ac, was specific to our target genes and in the examined areas.
Furthermore, modification of histone status is known to regulate the access of neuro-immune regulatory factors, such as CREB and NF-κB, to the DNA, which activation allows them to translocate from the cytoplasm to the cell nucleus and 'turn on' the expression of specific genes. Protein levels of phospho-CREB and NF-κB were evaluated in nuclear and cytoplasmic fractions and no significant variations were observed when comparing the nuclear and cytoplasmic fractions.
Subsequent, immunohistochemical analysis showed a specific glia and neuron immunopositivity towards H3S10p-K14ac in cerebral areas examined in LPS exposed animals. This led us to expand on this study using an in vitro microglia model, the immortalised murine cell line BV-2, as they have a broad role in the brain's innate immunity and in inflammatory neuropathologies. Preliminary data obtained in vitro confirmed our results. These results make the BV-2 model extremely suitable to study and better understand the molecular mechanism involved in epigenetic processes and it would accelerate research programmes while at the same time reducing the necessity of animal experimentation.
Finally, our data suggest a possible role for histone H3 phosphoacetylation in LPS induced sickness behavior as well as in the regulation of transcriptional mechanisms involved in the immune response. In this way, histone modification may represent the first of a cascade of genetic events that determine the behavioral alterations and sensitivity to stress observed after activation of the immune system.
|