Riassunto analitico
Background. Il Cannabidiolo (CBD), principio attivo della Cannabis Sativa, è una molecola ampiamente studiata in vari ambiti di ricerca al giorno d’oggi. In particolare, in seguito ad alcuni esperimenti condotti nel NanoBioLab del Dipartimento di Fisica dell’Università di Modena e Reggio Emilia, sembra che provochi delle alterazioni meccaniche a livello di membrane sintetiche, nonché conosciute con il termine di GUVs (Vescicole Unilamellari Giganti). I risultati di questi esperimenti hanno evidenziato come l'estratto decarbossilato di CBD fosse in grado di aumentare la fluttuazione della membrana senza però alterare la temperatura di transizione di fase. Dunque, partendo da questi presupposti siamo andati a valutare in che modo il CBD influenza le proprietà elettrotoniche delle GUVs sintetiche. Ipotesi. In questo studio l'obiettivo consiste nel verificare l'effetto del CBD 10 µM e del suo veicolo (DMSO 0,1%) sui valori di media di corrente di base e deviazione standard tramite le registrazioni effettuate mediante la tecnica del voltage-clamp, cell-attached, patch clamp. Metodi. Le GUVs sintetiche che vengono affrontate in questo progetto di ricerca sono allestite mediante elettroformazione, usando come lipide il DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) e come solvente il cloroformio. Considerando che la tecnica per eccellenza in grado di rilevare un’attività elettrica a livello della membrana è il patch clamp, siamo andati ad applicarla a livello delle GUVs, nonostante non siano mai stati pubblicati studi a riguardo. Dunque, in questa tesi abbiamo usato la tecnica del cell-attached, voltage-clamp, patch-clamp su GUVs immobilizzate su albumina sierica bovina. Una volta impostato il patch (GIGAseal) è stata registrata una corrente di base di 2 minuti con una tensione di mantenimento di -70 mV. Successivamente, 10 µM di Cannabidiolo (trattamento) o 0,1% DMSO (controllo) è stato applicato al bagno e la tensione della membrana è stata registrata per altri 5 minuti dopo l'applicazione del trattamento. Il controllo scelto per i suddetti esperimenti consiste nel DMSO (dimetilsolfossido), in quanto è stato dimostrato che sia in grado di interferire con i legami a idrogeno delle teste polari dei lipidi, compattandole. Risultati. Abbiamo osservato che è possibile eseguire la tecnica del patch clamp su membrane liposomiali, ma esclusivamente mediante la configurazione del cell-attached. Gli esperimenti sono stati condotti su 77 liposomi, aggiungendo sia il trattamento sia il controllo. Dalle registrazioni effettuate in questa modalità si è potuto notare come il CBD 10 µM influenzi la deviazione standard della media di corrente, specialmente in prossimità dell’immediata aggiunta alla membrana liposomiale, quindi a livello acuto. Si può anche osservare come il DMSO porti ad una riduzione significativa della deviazione standard, mentre il CBD la porti a valori più elevati. Ciò può essere correlato al fatto che il DMSO tende a compattare le membrane lipidiche, mentre il CBD ne aumenta la flessibilità. Conclusioni. Tali risultati confermano le osservazioni effettuate in passato riguardo la capacità del CBD di alterare le proprietà meccaniche a livello delle membrane artificiali e, in aggiunta, a dimostrare che gli effetti sono riscontrabili anche a livello di corrente. Questo, a sua volta, potrebbe essere traslato a livello di eccitabilità elettrica alterata in cellule viventi. Per confermare queste osservazioni sono necessari ulteriori studi volti a caratterizzare i cambiamenti nella resistenza di accesso e nella capacità delle GUVs.
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Abstract
Background. Cannabidiol (CBD), the active principle of Cannabis Sativa, is a widely studied molecule in various fields of research nowadays. However, it is not clear yet how it exerts its pharmacological action. Recent work conducted in the NanoBioLab of the Physics Department of the University of Modena and Reggio Emilia showed that CBD alters the mechanical and biophysical properties of synthetic membranes, as well as known by the term GUVs (Giant Unilamellar Vesicles). The results of these experiments showed that CBD decarboxylate extract was able to increase membrane fluctuation without altering the phase transition temperature. .As the modulation of a biological membrane mechanical and biophysical properties can be causally related to the change of its electrical properties, in this work we have hypothesized that CBD can affect the electrotonic properties of GUVs.
Aim of the study. ln this study we aim to test the effect of CBD 10 µM and its vehicle (DMSO 0.1%) on the holding currents mean values and standard deviation of voltage-clamp, cell attached, patch-clamp recordings.
Methods. The synthetic GUVs examined in this research project were prepared by electroformation, using DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) as lipid and chloroform as solvent. We have subsequently conducted cell-attached, voltage-clamp, patch-clamp recordings on GUVs immobilized on 13 mm glass coverslips coated with bovine serum albumin. Once the patch (GIGAseal) was set, a holding current of 2 minutes was recorded with a maintenance voltage of -70 mV as baseline. Subsequently, 10 µm of Cannabidiol (treatment) or 0.1% DMSO (control) was applied to the bath and the holding current mean, peak and standard deviation recorded for another 5 minutes after the application of treatment. The chosen control for these experiments consists of DMSO (dimethyl sulfoxide), since it has been shown to interfere with the hydrogen bonds of the lipid polar heads, compacting them.
Results. We have observed that it is possible to perform the patch clamp recordings on liposomal membranes, in the cell-attached configuration. Experiments were conducted on 77 liposomes, adding both either treatment and control on each patched liposome. We have observed that the acute administration of CBD 10 µM leads to an increase in the standard deviation of the holding current in comparison to the DMSO 0.1% treated GUVs. It can also be observed that DMSO leads to a significant reduction in the standard deviation, while CBD leads to higher values compared to their respective baseline. This can be related to the fact that DMSO tends to compact lipid membranes, while CBD increases their flexibility.
Conclusions. These outcomes confirm past observations of the ability of CBD to alter mechanical properties at the level of artificial membranes and, in addition, to demonstrate that effects are also present at the level of the membrane electrical properties. This, in turn, could be translated to the level of altered electrical excitability observed in living cells following CBD addition. Further studies aimed at characterizing changes in the GUVs access resistance and capacitance are needed to confirm these observations.
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