Riassunto analitico
La GM1-gangliosidosi è una rara malattia di accumulo lisosomiale (LSD), autosomica recessiva. È causata da mutazioni sul gene GLB1 che codifica per l’idrolasi lisosomiale β-galattosidasi. La GMI1-gangliosidosi infantile è caratterizzata da ritardo dello sviluppo nervoso, ipotonia, disfagia, convulsioni e morte entro i primi tre anni di vita. A causa della rapida progressione e severità della patologia, dovuta all’accumulo di metaboliti non degradati e meccanismi secondari di danno cellulare, la correzione richiede una rapida e robusta distribuzione dell’enzima nell’intero sistema nervoso centrale, e possibilmente una riduzione della infiammazione locale. Attualmente non sono disponibili cure per la GM1 gangliosidosi. La terapia genica ex-vivo intesa come trapianto autologo di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche geneticamente corrette in-vitro mediante vettori lentivirali, può rappresentare una valida opzione terapeutica per le LSD. La potenzialità di questa strategia nei per il trattamento di LSD con componente neurodegenerativa è stata provata in numerosi studi preclinici e nel contesto in studi clinici su pazienti presintomatici per la Leucodistrofia metacromatica e Mucopolisaccaridosi di tipo I e tipo IIIA. Il razionale è che i progenitori mieloidi, metabolicamente competenti, derivati dalle HSPCs trapiantate siano in grado di ripopolare i tessuti del paziente, includendo il SNC, restaurando l’attività metabolica difettiva e una normale funzione scavenger, limitando l’accumulo e mitigando i danni tissutali. Ispirati da questi risultati abbiamo disegnato una terapia genica ex-vivo basata sul trapianto autologo di HSPC per la GM1 gangliosidosi mirata alla prevenzione e correzione delle manifestazioni di malattia nel modello animale di malattia. A causa della natura rapida e severa di questa malattia prevediamo la necessità di una rapida e sostanziosa distribuzione di enzima nel SNC, combinata alla modulazione della neuro infiammazione, stress ossidativo e degenerazione neuronale. Con questo obbiettivo, come progetto di tesi, ho contribuito al design e allo sviluppo di un putativo vettore lentivirale (LV) terapeutico per il trasferimento, efficiente e sicuro, di multiple copie del gene terapeutico in cellule umane primarie in grado di esprimere livelli suprafisiologici dell’enzima terapeutico. Abbiamo disegnato tre diversi candidati LV che esprimono la sequenza del gene GLB1 umano wild type o il cDNA ottimizzato (co) o una versione artificiale del cDNA del gene GLB1 disegnato per ottimizzare la secrezione della proteina. Dopo una prima fase di screening in una linea cellulare ematopoietica umana, abbiamo scelto il vettore esprimente la sequenza ottimizzata del cDNA del gene GLB1 (LV-huGLB1co) per la successiva caratterizzazione. Questo vettore può essere prodotto a elevato titolo, è in grado di trasdurre line cellullari ematopoietiche umane e cellule primarie derivate da pazienti in modo sicuro ed efficiente, determinando una correzione genetica e metabolica in assenza di tossicità. Mediante saggio enzimatico standard, abbiamo dimostrato che il vettore LV-huGLB1co può indurre una attività soprafisiologica e dose-dipendente di β-galactosidasi nelle cellule trasdotte, e che la proteina viene secreta nel medio di cultura e internalizzata da cellule target esposte. Come prossimo step, nello sviluppo preclinico di una strategia di terapia genica sicura ed afficace per il trattamento della GM1 gangliosidosii, procederemo con la validazione in vivo del vettore terapeutico e delal intera procedura di terapia genica, in uno studio di fattibilità ed efficacia nel mosdello murino di malattia.
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Abstract
GM1-gangliosidosis (OMIM #230500) is a rare, autosomal recessive, neurodegenerative Lysosomal Storage Disorder (LSD). It is caused by mutations in the GLB1 gene, encoding the lysosomal hydrolase β-galactosidase. Infantile GM1-gangliosidosis is characterized by neurodevelopmental delay, hypotonia, dysphagia, seizures, and death by 3 years of life. Due to the rapid progression and severe nature of this disease, which involves the storage of undegraded metabolites and secondary mechanisms of cell damage, correction requires a rapid and robust enzyme delivery to the whole central nervous system (CNS), possibly associated with a reduction of local inflammation. There is no cure for GM1-gangliosidosis to date. Ex vivo Gene therapy (GT), i.e. the autologous transplantation of hematopoietic stem/progenitor cell (HSC) genetically-corrected by lentiviral gene transfer, can represent a valuable therapeutic option for LSDs. The potential of this approach to benefit neurodegenerative LSDs, including Metachromatic Leukodystrophy, Mucopolysaccharidosis Type I and type IIIA, was proven in multiple preclinical studies, and in pre-symptomatic patients in the context of pivotal clinical trials. The rationale is that the metabolically-competent myeloid progeny of the transplanted HSCs, repopulate the patient’s tissues, including the CNS, and restore the defective metabolic activity and a normal scavenging function, rescuing the storage and mitigating tissue damage.
Inspired by these results, we designed an HSC-based ex vivo GT strategy for infantile GM-1 gangliosidosis aimed at preventing and correcting the disease manifestations in the animal model of the disease. Due to the rapid and severe nature of this disease, we envisage the need for a rapid and considerable enzyme delivery to the whole CNS combined to the modulation of neuroinflammation, oxidative stress, and neural degeneration. To this goal, as a Thesis’s internship project, I contributed to the design and development of a putative therapeutic Lentiviral Vector (LV) able to safely and efficiently deliver multiple copies of the therapeutic gene into human primary cells, and express supra-physiological levels of the therapeutic enzyme. We designed three different candidates LVs expressing either the wild-type sequence of the human GLB1 cDNA or a codon-optimized (c.o.) version, or an artificial GLB1 cDNA designed for improved protein secretion. After the first screening in human hematopoietic cell lines, we chose the LV expressing the c.o. GLB1 cDNA (LV-huGLB1co) for further characterization. This vector can be produced at high titer and is able to transduce human hematopoietic cell lines and patient-derived primary cells safely and efficiently, determining genetic and metabolic correction in the absence of toxicity. We demonstrated LV-huGLB1co can induce a dose-dependent supraphysiological activity of β-galactosidase in the transduced cells, as determined by standard enzymatic assays, which is correctly secreted in the culture medium and uptaken by exposed target cells.
For the next step of preclinical development of a safe and efficacious GT strategy for GM1-Gangliosidosis, we will proceed with the in vivo validation of the therapeutic vector and the whole strategy, in a feasibility and efficacy study performed in the animal model of the disease.
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