Riassunto analitico
Il sistema del complemento gioca un ruolo importante nel mantenimento di varie funzioni fisiologiche dell’organismo umano. Nelle ultime decadi, l’interesse scientifico verso questo complicato sistema si è accresciuto, in quanto una sua inappropriata regolazione risulta coinvolta in una serie di malattie infiammatorie e autoimmuni, come l’emoglobinuria parossistica notturna, il lupus eritematoso sistemico, e l’angioedema ereditario. Il nostro interesse si è focalizzato sul complesso C1, poiché questo è il primo complesso della via classica responsabile dell’attivazione della cascata enzimatica, e quindi una sua inibizione può fermare l’attivazione del sistema in fase precoce. Al momento, si trovano in commercio in Europa solo inibitori proteici del complesso C1; questi sono estratti dell’inibitore fisiologico (C1-Inh) purificati dal plasma (commercializzati col nome di Cinryze® e Berinert®) o prodotti ricombinanti di questo (Ruconest®). Nessuna small molecule inibitrice di C1s è ancora stata approvata, anche se alcuni composti sono sotto indagine in trials clinici. Un piccolo gruppo di molecole con alta attività inibitoria verso C1s è pubblicato in letteratura, molte di queste molecole presentano un gruppo ammidico o guanidinico (o entrambi), come FUT-175 (conosciuta anche come Nafamostat) e BCX-1470. Lo scopo di questo studio è di esplorare, utilizzando diversi metodi computazionali, le interazioni target-ligando e le relazioni struttura-attività degli inibitori small molecule conosciuti, cosi come identificare nuove small molecule inibitori di C1s. Una libreria di 50 molecole con caratteristiche strutturali diverse è stata precedentemente creata attraverso una ricerca di similarità 2D da database di milioni di composti. I composti provenienti dalla letteratura e dalla libreria focalizzata sono stati dockati nella struttura cristallografica X-ray dell’enzima C1s utilizzando il software Glide. Ci siamo focalizzati sul dominio proteasico, in prossimità della serina catalitica (Ser617), il più probabile punto di inibizione. Nonostante le pose di docking e le interazioni fossero comparabili con quelle dalla letteratura, i Docking Score non erano all’altezza delle nostre aspettative, soprattutto nel caso di composti senza gruppi ammidici. Inoltre, il protocollo di docking non è risultato in grado di distinguere in modo affidabile i composti attivi dagli inattivi.
Al fine di ovviare a queste lacune, sono stati creati anche modelli farmacoforici utilizzando il software Phase. I composti attivi sono stati raggruppati secondo i loro nuclei chimici e sono state create delle ipotesi farmacoforiche per ogni sottogruppo. Queste ipotesi sono state valutate secondo il loro BEDROC e survival score e la miglior ipotesi di ogni gruppo è stata utilizzata per un pharmacophore-based virtual screening. Milioni di composti preselezionati da database commerciali sono stato testati e i composti con il più alto score sono stati biologicamente testati in vitro. Sei dei composti testati sono risultati attivi (in concentrazione di μM) e due di questi presentano una struttura diversa dalle precedenti. Inoltre, tutte le molecole di questi database sono state dockate e quelle con i migliori docking score sono state anche biologicamente testate, ma nessuna di queste si è dimostrata attiva.
Come step finale di questo studio computazionale, due diversi tipi di modelli QSAR sono stati realizzati basandosi sui dati della letteratura. Un Field-based 3D-QSAR basato sull’allineamento farmacoforico ed un modello basato sulle MOLPRINT_2D fingerprints sono stati creati. I parametri statistici indicano che questi modelli possono essere adeguati a predire l’attività inibitoria verso C1s di nuovi composti di struttura simile, e potrebbero anche aiutare a capire meglio le relazioni struttura-attività e contribuire alla progettazione di nuovi composti.
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Abstract
The complement system plays an important role in the maintenance of various physiological functions of the human body. In the last decades, the scientific interest in this complex network has been increased, since its inappropriate regulation seems to be responsible for a series of inflammatory and autoimmune diseases, such as paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, systemic lupus erythematosus, and hereditary angioedema. The C1 protein was in the focus of our interest because this is the first complex of the classical pathway responsible for the activation of the enzymatic cascade, therefore its inhibition can stop the activation of the system at an early stage. To date, only protein inhibitors of the C1 complex are commercially available in Europe, these are either extracted and purified from plasma (under the trade name of Cinryze and Berinert) or manufactured as a recombinant product (under the trade name of Ruconest). No small molecule C1s inhibitors have been approved yet, although some compounds are under investigation in clinical trials. A handful of active molecules has been published in the literature with high inhibitory activity on C1s, most of them with amidine or guanidine (or both) functional group, like FUT-175 (also known as Nafamostat) and BCX-1470. The purpose of this study is to utilize various computational methods to investigate the target-ligand interactions and structure-activity relationships of the known small molecule inhibitors as well as to identify novel small molecules C1s inhibitors. A library of 50 molecules with different structural characteristics was previously created through a 2D-similarity search of databases of millions of compounds. The compounds from literature and the focused library have been docked into the X-ray crystallographic structure of the C1s enzyme using Glide software. We were focusing on the protease domain, in the proximity of the catalytic serine (Ser617), the most likely point of the inhibition. Although the docking poses and interactions were comparable with those from the literature, the Docking Scores have fallen short of our expectations especially in the case of the compounds with no amidine groups. Also, the docking protocol was unable to reliably distinguish between active and inactive compounds.
In order to overcome these shortcomings, pharmacophore models have been also developed using Phase software. The active compounds have been grouped according to their chemical cores and pharmacophore hypotheses have been created for each subtype. These hypotheses have been evaluated by their BEDROC and survival scores and the best hypotheses for each group have been applied for a pharmacophore-based virtual screening. Millions of pre-selected compounds from commercial databases have been tested and compounds with the highest scores have been investigated in an in vitro biological activity study. Six of the tested compounds proved to be active (in μM concentration) and two of them were even different from the existing scaffolds. In addition, all the molecules from these databases have been docked and the ones with the best docking scores have been also biologically tested, but none of them proved to be active.
As the final step of this computational study, two different types of QSAR models have been also developed based on literature data. A Field-based 3D-QSAR model based on pharmacophore alignment and an alignment-free model based on the MOLPRINT_2D fingerprints were created. The statistical parameters are indicating that these models could be adequate to predict the C1s inhibitory activity of new compounds with similar structures and may also help to better understand the structure-activity relationships and contribute to the design of new compounds.
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