Riassunto analitico
Durante il processo di ricerca di un farmaco, molti hits mostrano un’interessante attività verso il target a livelli nanomolari, ma una limitata efficacia se devono agire all’interno della cellula. La progettazione di un farmaco dovrebbe considerare l’intero percorso che esso compie per raggiungere il target, valutando tutti gli aspetti del drug-walk to the target quali permeabilità cellulare, distribuzione, degradazione, eliminazione e interazione col target. Questo concetto è stato applicato al progetto AIRC2015-IG696779 ‘Protein-protein interaction inhibitors of thymidylate synthase against colorectal cancer’, in cui rientra il mio progetto di tesi. L’obiettivo del progetto è sviluppare molecole in grado di perturbare il dimero dell’hTS in favore del monomero, per superare il problema della farmaco-resistenza. Precedentemente queste molecole sono state identificate attraverso un approccio di tethering. Recentemente sono entrate a far parte di un programma hit-to-lead con l’intento di migliorare l’attività inibitoria, la citotossicità e le proprietà chimico-fisiche. Considerando due fasi del drug-walk, farmacocinetica cellulare e interazione col target, l’obiettivo del mio progetto di tesi è stato quello di (A) sviluppare nuovi composti migliorando l’attività enzimatica e cellulare e (B) quantificarne la concentrazione intracellulare. Nella prima parte, basandomi su un approccio di scaffold-hopping applicato agli inibitori precedentemente identificati, mi sono occupata della progettazione e della sintesi di 33 nuovi composti, valutandone l’attività inibitoria sulla proteina attraverso il saggio di cinetica enzimatica. Quasi tutti i composti hanno mostrato un profilo di inibizione comparabile o aumentato rispetto agli hits, con valori di IC50 da 2.7 a 30 uM. Allo stesso tempo, risultati preliminari ottenuti dal saggio di FRET (valuta l’effetto dissociativo sul dimero) hanno rivelato la capacità dei composti di perturbare la forma dimerica dell’enzima. In particolare, i composti 1d, 2a e 2d hanno un IC50 di 10.3, 21.7, 24.6 uM associato a un valore di FRET di -0.20, -0.50, -0.60. E’ stata testata la capacità di inibire la crescita tumorale dei composti su linee cellulari HT29 e A2780/CP. I dati mostrano una buona attività enzimatica, ma scarsa attività cellulare. Con l’obiettivo di investigare se l’effetto cellulare è dovuto ad una mancanza di permeabilità o ad un’instabilità del composto, la seconda parte del mio progetto di tesi è focalizzata sulla quantificazione della concentrazione intracellulare dei composti, in particolare il composto 2d che ha mostrato un IC50 di 21 uM, una FRET di -0.6, ma un’inibizione della crescita cellulare del 15% a 40 uM e quello di riferimento LC1343. Dopo aver trattato le cellule HT29 con 2d e LC1343, a 5 tempi di incubazione, ho applicato il protocollo di estrazione e determinato la concentrazione intracellulare dei composti mediante spettrometria di massa. I dati mostrano che, dopo un picco iniziale, la concentrazione del composto 2d diminuisce nelle quattro ore, mentre la concentrazione di LC1343 aumenta. Il composto 2d non è in grado di raggiungere la concentrazione intracellulare necessaria ad inibire l’hTS provocandone la morte cellulare. A supporto di questa evidenza, alcuni analoghi Fmoc protetti più lipofili sono stati testati su linee cellulari mostrando una maggiore attività cellulare rispetto ai derivati che presentano il gruppo aminico libero. I risultati suggeriscono che una modulazione della lipofilia è necessaria per permettere alle molecole di raggiungere il loro target intracellulare. In conclusione, ho ottenuto nuovi promettenti inibitori dissociativi della hTS con un profilo enzimatico migliorato e validato e ho investigato il loro drug-walk cellulare. Saranno necessarie ulteriori modulazioni strutturali per bilanciare la guadagnata attività enzimatica con un adeguato profilo farmacocinetico cellulare.
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Abstract
Even though many hit compounds developed during a drug discovery process show an interesting anti-target activity at low nanomolar levels, they suffer limited cellular efficacy if they have to act intracellularly. Therefore, the drug design should consider the whole walk that the candidate drug has to cover in order to reach its target, evaluating all the aspects of the drug-walk to the target such as membrane permeability, distribution, degradation, elimination and drug target interaction. This concept was applied during the drug development phase of AIRC2015-IG696779 ‘Protein-protein interaction inhibitors of thymidylate synthase against colorectal cancer’ project, as issue of my thesis project. The aim of the program is to develop molecules able to disrupt the hTS dimer in favor of the monomer, in order to overcome the problem of drug-resistance. Previously, these molecules were identified through tethering approach. Currently, they entered in a hit-to-lead program with the intent to improve their hTS inhibitor activity, cytotoxicity potential and physicochemical features. Considering two steps of the drug-walk phases, cellular pharmacokinetic and drug target interaction, the aim of my thesis work was (A)to develop new compounds improving enzymatic and cellular activity and (B) to quantify the intracellular concentration of the compounds. In the first part of my thesis project, basing on a scaffold-hopping approach applied to the previously identified inhibitors, I dealt with the design and synthesis of 33 new compounds, evaluating at the same time their protein inhibitor activity through enzymatic kinetic assay. Almost all the compounds showed an improved or comparable hTS inhibitor profile, with the respect of the first hits identified, with hTS IC50 ranging from 2.7 to 30 uM. At the same time, the preliminary results obtained by FRET assay (methodology to evaluate the dissociative effect on the dimer) revealed the capability of these compounds to disrupt the dimeric form of hTS. In particular, compounds 1d, 2a and 2d reported an hTS IC50 of 10.3, 21.7, 24.6 uM, associated to a drop in FRET efficiency of -0.20, -0.50, -0.60 respectively. All the synthesized compounds were assayed for their cancer cell grow inhibitory activity against HT29 and A2780/CP cell lines. Data showed a good enzymatic activity on recombinant hTS, but low activity at cellular level. With the aim to investigate if the low cell growth inhibition effect was due to the lack of membrane permeation or to compound instability, the second part of my thesis project focused on the quantification of intracellular compounds concentrations, in particular 2d and compound of reference LC1343. Compound 2d showed an IC50 of 21 uM on hTS, FRET value of -0.6 and a cellular growth inhibition of 15% at 40 uM on cancer cell lines. Therefore, I performed the extraction protocol on HT29 cell line lysates after treatment with 2d and LC1343 at 5 times of incubation and I determined the quantification of the intracellular concentration of compounds by mass spectrometry. Data showed that, after an initial peak, the concentration of 2d decrease within the four hours, whereas the concentration of LC1343 increased. Therefore, 2d is not able to reach the necessary intracellular concentration to cause the hTS inhibition leading the cell to death. In support of this evidence, some more lipophylic Fmoc protected analogues were tested on cells showing a higher cellular activity than the respective free-amine derivatives. The results suggest that a modulation of the lipophilicity is necessary to allow the molecules to reach their intracellular target. Concluding, I was able to obtain new promising dissociative inhibitors of hTS with an improved and validated enzymatic profile and investigated their cellular drug-walk. However, further structural modulation are required in order to balance their gained enzymatic activity with an adequate cellular pharmacokinetic profile.
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