Riassunto analitico
L’obiettivo della scoperta farmaceutica è sviluppare composti efficaci e sicuri per trattare patologie umane. Lo sviluppo di farmaci moderni per una data malattia ha inizio con un’ analisi “target-based” o “phenotypic-based” di una libreria di composti.
Prima che il metodo target-based divenne popolare, la scoperta farmaceutica era basata su strategie di analisi fenotipica. Negli scorsi 25 anni, lo screening farmacologico mirato a bersagli molecolari è diventato il principale metodo di scoperta di nuovi composti, utilizzato sia nell'industria farmaceutica che nei centri di ricerca accademici. Basandosi su questo, tutti i composti che non mostrano un’inibizione diretta al target, perfino presentando un effetto fenotipico, vengono scartati attribuendogli effetti off-target.
Recentemente, l’approccio fenotipico è stato rivalutato a causa del drastico declino del numero di nuove molecole che hanno raggiunto il mercato, associandolo all’introduzione del “target-based approach”.
Nel mio lavoro di tesi, considerando il problema sopra citato, si valutano test specifici per evidenziare la capacità di inibitori della crescita cellulare di modulare o bloccare il target intracellulare nonostante la forte lipofilia e l’apparente azione limitata sul target.
In questo ambito, il mio lavoro di tesi sperimentale per la laurea in Chimica e Tecnologie Farmaceutiche fa parte del progetto AIRC (AIRC2015-IG16977 ‘Protein-protein interaction inhibitors of thymidylate synthase against colorectal cancer’), coordinato dalla Professoressa M.P.Costi.
Il composto promettente in questo progetto AIRC, LC1343, mostra una IC50 di 7µM verso la proteina hTS e un’attività in vivo due volte maggiore del 5-Fluorouracile. Il composto è molto lipofilo e mostra capacità di inibizione sulla crescita tumorale in modelli di “xenograf nude mice” maggiore del 5FU.
Lo scopo generale del mio progetto di tesi è di sviluppare nuovi inibitori dissociativi in grado di indurre una perturbazione nell’ equilibrio monomero-dimero in favore della forma monomerica, così da inibire la funzione catalitica e mantenere la funzione regolatoria.
Gli obiettivi secondari sono i seguenti: 1. aumentare la solubilità dei composti introducendo sostituenti idrofili per ottenere le proprietà molecolari per poter effettuare i testi in vitro; 2. comprendere la relazione tra lipofilia e attività citotossica; 3. studiare la relazione tra citotossicità e inibizione del target ad opera dei nuovi derivati del LC1343, valutando la proteina di interesse e altre proteine coinvolte nel ciclo dei folati.
A questo scopo, il mio lavoro di tesi è diviso in due parti. Nella prima parte del mio lavoro, ho valutato l’inibizione della crescita cellulare di due serie di composti, derivati dal LC1306 (AIC-A) e dal LC1343 (AIC-C), testati a 40 µM su linee HT29 CRC e A2780/CP OC.
A partire dai risultati ottenuti, sei composti sono stati selezionati per sviluppare la curva di tossicità sulle stesse line cellulari (HT29 CRC e A2780/CP OC), HTC116 CRC (resistenti al 5FU) e A2780 OC (sensibili al cisplatino).
I dati mostrano che AIC-C16 e C19, derivati del LC1343, sembrano essere i più attivi su tutte le linee cellulari. Solitamente, i composti AIC-C presentano grande attività citotossica su linee di CRC e OC, ma hanno una bassa attività enzimatica su hTS dovuta probabilmente alla loro bassa solubilità.
Partendo dal miglior composto ottenuto AIC-C16, ho focalizzato la seconda parte del mio progetto di Tesi sulla progettazione, la sintesi e la caratterizzazione di 16 nuovi derivati, analoghi del precursore LC1343, con lo scopo di migliorare l’attività inibitoria dissociativa, il profilo farmacocinetico e aumentare la solubilità.
Su questi nuovi composti sono stati svolti saggi biologici quali test di citotossicità, di affinità su hTS, attività di TS su linee cellulari e Western Blot sulle proteine GART, DHFR e hTS.
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Abstract
The goal of drug discovery is to develop efficacious and safe therapeutics compounds for the treatment of human diseases. Modern drug development usually begins with either target-based or phenotypic-based screening of a compound library.
Before target-based approach became popular, pharmaceutical drug discovery was focused on phenotypic screening strategies. In the past 25 years, molecular target-based drug screening has become the main drug discovery paradigm used in both the pharmaceutical industry and academic research centres. Based on this concept, all compounds that did not show a direct target inhibition, even in the presence of a phenotypic effect, where discarded considering the off-targets effect.
Recently, the phenotypic approach has raised interest for lead discovery because of a steady decline in the number of new molecules that reach the market was ascribed to the apparent low impact of target-based drug discovery.
In my thesis work, I considered the above described concept and evaluated specific assays to highlight the potential capacity of effective cancer cell growth inhibitors to modulate or engage the intracellular target despite the fact that they show high lipophilicity and apparently limited target inhibition effect (high off-target inhibition potential).
In this context, I developed my experimental work for the degree thesis in Pharmaceutical Chemistry and Technology within the AIRC project (AIRC2015-IG16977 ‘Protein-protein interaction inhibitors of thymidylate synthase against colorectal cancer’), coordinated by Professor M.P. Costi.
The lead compound of the AIRC project, LC1343, shows a 7 µM IC50 against hTS protein and in vivo efficacy 2 times higher than 5-Fluorouracil (5FU) as drug of reference. The compound is very lipophilic and shows the capability to inhibit tumour growth in xenograft cancer in nude mice model, more effectively than 5FU.
The global aim of my thesis project is to develop new inhibitors able to induce a perturbation in the dimer-monomer equilibrium in favour of the monomeric form, thus inhibiting the catalytic function and preserving the regulatory activity.
The specific aims are the following: 1. To increase solubility of LC1343 introducing hydrophilic substituents to confirm molecular properties for performing in vitro assays; 2. to understand the relationships between lipophilicity and activity; 3. to study the relationship between cytotoxicity and target inhibition evaluating specific target and off target proteins involved in folate cycle.
With this purpose, my work is divided in two parts. In the first part of my thesis work I evaluated the cancer cell growth inhibitory activity of two series of compounds derived from LC1306 (AIC-A) and LC1343 (AIC-C) compounds at 40uM to understand which of these are able to inhibit cell growth on HT29 and A2780/CP cell lines.
Starting with these data, six compounds have been selected to obtain dose-response curves on the same cell lines (HT29 and A2780/CP), HCT116 CRC cell line (resistant to 5FU) and A2780 OC cell line (counterpart cisplatin sensitive). Data analysis suggests that AIC-C16 and C19, LC1343 derivatives, are the most active compounds against both cell models. Generally, AIC-C compounds have a great cytotoxic activity on CRC and OC cell lines but show a moderate inhibition against hTS enzyme.
Starting with the best compound AIC-C16, in the second phase of my work, I focused on the design, synthesis and biological characterization of 16 new derivatives, analogues of drug lead LC1343, with the purpose to improve the dissociative-inhibitor activity, its pharmacokinetic profile and increase the solubility.
On these novel compounds we have done a biological evaluation: cytotoxic assay, hTS affinity, TS activity in cell lines and Western Blot on Gart, DHFR and hTS proteins have been conducted.
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