Riassunto analitico
Le connessioni tra sistema immunitario e neuroendocrino mediano risposte complesse e fondamentali per il mantenimento dell’omeostasi dell’organismo. Nei mammiferi, il sistema immuno-neuroendocrino (INE) ed i fattori solubili che agiscono da segnali immunitari e/o da neurotrasmettitori in base alla situazione contingente sono stati ben caratterizzati. Negli invertebrati, sono state raccolte evidenze circa l’esistenza dell’integrazione INE ma si è lontani da una descrizione sistematica dei meccanismi molecolari e dei fattori solubili coinvolti. Scopo della mia tesi è l’analisi, mediante tecniche di morfologia avanzata e biologia molecolare, di fattori solubili coinvolti nel sistema INE in phyla rappresentativi di invertebrati protostomi: artropodi, molluschi, anellidi e platelminti. I primi esperimenti sono stati effettuati sulla linea cellulare S2 derivata da emociti larvali di Drosophila melanogaster, modello di artropode, per caratterizzare il ruolo di Helical factor (Hf), prima citochina putativa ad alfa-elica individuata in invertebrato. Ho quindi dimostrato il coinvolgimento diretto di Hf nella risposta immunitaria di D. melanogaster e l’aumento della sua espressione in concomitanza con quella dei peptidi antimicrobici. Nell’ambito dei molluschi, ho scelto di caratterizzare il sistema INE del gasteropode d’acqua dolce, Pomacea canaliculata, effettuandone la prima caratterizzazione morfologica e funzionale degli emociti. Inoltre, ho utilizzato, per la prima volta in un mollusco, la positività ad un marker del ciclo cellulare per localizzare il suo tessuto ematopoietico. In P. canaliculata, ho inoltre dimostrato, per la prima volta nei molluschi, che uno stimolo immunitario (iniezione intra-muscolare di estratto batterico) induce l’insorgenza di modificazioni epigenetiche in cellule nervose, modificandone il pattern di espressione genica. Grazie alla capacità di P. canaliculata di rigenerare de novo organi sensoriali anche in fase adulta, ho ottenuto un database dai trascrittomi dei tessuti rigeneranti a diversi tempi sperimentali. Tale piattaforma molecolare sarà fondamentale per studiare il ruolo di fattori immunitari nei processi rigenerativi di tessuti nervosi ed insieme agli altri dati raccolti permetterà di studiare la maturazione degli emociti e ricercare le connessioni tra ematopoiesi e segnalazione nervosa già dimostrate negli artropodi. Analogamente a P. canaliculata, gli studi che ho effettuato in vitro sul sistema nervoso dell’anellide Hirudo medicinalis hanno mostrato una connessione INE anche in questo taxon. In particolare, ho documentato la presenza e l’aumento dell’espressione del fattore solubile allograft inflammatory factor-1 nelle cellule microgliali sia in seguito a lesione dei neuroni sia dopo stimolazione immunitaria. L’eventuale ruolo del sistema immunitario nel processo rigenerativo di elementi nervosi e non-nervosi è stato infine studiato nel platelminta, Schmidtea mediterranea. Dopo aver individuato per via bioinformatica fattori solubili con potenziale ruolo immunitario, ho analizzato la loro espressione in seguito a stimolo immunitario e/o amputazione. Le osservazioni condotte suggeriscono che i fattori solubili presenti nel muco che ricopre S. mediterranea siano fondamentali per prevenire infezioni, ma ancora non è chiaro se tali molecole siano indispensabili anche come co-fattori del processo di rigenerazione. Nella presente tesi ho raccolto una cospicua mole di dati originali circa l’attività di molecole solubili, coinvolte nel funzionamento del sistema INE dei protostomi. L’analisi complessiva dei dati indica che l’interazione INE è un processo rintracciabile ed attivo nei principali phyla di protostomi, suggerendo una forte conservazione evolutiva dell’integrazione INE, già plausibilmente presente in organismi ancestrali.
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Abstract
Functional connections between the immune and the neuroendocrine systems have a fundamental role for the organism homeostasis. The mammalian immune-neuroendocrine (INE) responses are integrated by soluble factors (SFs) that act as immune signals and/or neurotransmitters on the basis of the contingency. Molecules and pathways responsible for INE integration are well characterized in mammals. In invertebrates, scanty evidence of the INE integration has been collected so far, and a fine description of the molecular mechanisms and of the SFs involved in both INE integration and evolution is missing.
Aim of my thesis is the analysis of SFs involved in INE functions within the most representative protostomian phyla: arthropods, annelids, molluscs and platyhelminthes. I applied advanced morphological techniques and molecular biology protocols on each model.
The S2 hemocyte cell line, derived from the embryo of Drosophila melanogaster was chosen as arthropod model. In S2 cells I characterized the role of Helical factor (Hf), the first putative alpha-helical cytokine identified in invertebrates. I demonstrated the involvement of Hf in D. melanogaster immune response by showing that Hf expression increases together with that of antimicrobial peptide after an immune challenge.
The freshwater gastropod (mollusc), Pomacea canaliculata (Pc), was selected because of its increasing importance as an agricultural pest and human-parasite intermediate host. Given the absence of information on Pc immune system, I performed the first morphological and functional characterization of its hemocytes. By looking for a highly specific and conserved mitotic marker, I localized the Pc hematopoietic tissue with a method never used in the molluscs.
The direct effects of an immune challenge on gene expression of neurons was demonstrated for the first time in the molluscs by injecting Pc with a bacterial extract. The immune challenge induced an epigenetic modification of the neural cells and modified neuron gene expression. This represents one of the most significant evidence concerning INE integration ever collected in mollusca.
Adult Pc present the unusual ability to regenerate de novo the sensory organs. I obtained a database comprising transcriptomes from the regenerating sensory organs at several stages. This molecular platform will be an invaluable tool for the analysis of the role of immune-related SFs in the regeneration of the nervous system. The database will also represent the background for analyzing the hemocyte maturation and the connection between hematopoiesis and neuroendocrine functions, as it has already been performed in arthropods.
Similarly to Pc, the in vitro analysis performed on the nervous system of the annelid Hirudo medicinalis confirmed the presence of INE integration also in this taxon. More in detail, the expression of the SF allograft inflammatory factor-1, a marker of activated macrophages in humans, was increased in activated microglial cells after performing either axon lesion or immune challenge.
I analyzed the role of the immune-related SFs during the regeneration process of neural and non-neural components in the platyhelminthes, Schmidtea mediterranea. I identified immune-related SFs bioinformatically from a S. mediterranea transcriptome database, and their expression was evaluated after immune challenge and/or amputation. The collected data suggested that the main role of the selected SFs is the organism defense, whereas their specific role during the regenerative process is not demonstrated, yet.
My thesis presents new and relevant information about the SFs involved in the INE connection of several protostomian models. The analysis of the whole body of data shows that the INE interaction is present and functions in all the most represented protostomian phyla, strongly supporting the hypothesis of the evolutive conservation of traits already present in the ancestral progenitors of present-day metazoan.
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