Riassunto analitico
Negli ultimi decenni le terapie basate sulle cellule staminali hanno conosciuto una rapida evoluzione e progresso. Un esempio di approccio clinico validato basato sul potenziale delle cellule staminali è il trapianto epiteliale limbare autologo coltivato (CLET), sviluppato per il trattamento del deficit di cellule staminali limbari (LSCD) e commercializzato come Holoclar®. LSCD è una condizione rara che causa significativa opacizzazione corneale, vascolarizzazione e cicatrici, spesso con conseguenti gravi come disturbi della vista o la perdità di vista. Pellegrini et al. ha dimostrato che il trapianto autologo di cellule staminali limbari coltivate (CLET) ottenute da una biopsia limbare di 1-2 mm2 potrebbe ripristinare la superficie corneale in pazienti affetti da LSCD totale, con un tasso di successo del 76,6%. Le cellule staminali limbari sono cellule staminali adulte situate nel limbo, la nicchia delle cellule staminali epiteliali corneali, e garantiscono un continuo rinnovamento dell'epitelio corneale in caso di danno. Sono stati studiati diversi biomarcatori delle cellule staminali limbari, ma solo uno è stato validato clinicamente, Np63 alfa. È stato proposto un altro marcatore, ABCB5 [cassetta legante l'ATP, sottofamiglia B (MDR/TAP), membro 5], una proteina della membrana plasmatica e membro della famiglia della glicoproteina P umana, che ha dimostrato di essere sovraespresso dalle cellule staminali tumorali (CSC) in diversi tumori umani e associati alla progressione clinica del tumore, alla resistenza terapeutica e alla recidiva nei pazienti con cancro. ABCB5 è stato identificato per la prima volta come marcatore delle cellule progenitrici della pelle e delle cellule staminali del melanoma, funzionando come regolatore della differenziazione cellulare. Sulla base di queste ultime proprietà, Ksander et al. hanno ipotizzato che ABCB5 potrebbe anche identificare il ciclo lento, etichettando le cellule staminali limbari nell'occhio. Analizzando l'espressione della proteina ABCB5 nel limbo delle cellule umane o dei topi, hanno suggerito che ABCB5 sia un produttore di cellule staminali limbari. In questa tesi, abbiamo studiato l'espressione e la stabilità di ABCB5 in una linea cellulare derivante da melanociti, cellule SK-MEL-28, che presenta un'elevata espressione di ABCB5. I livelli di espressione di ABCB5 sono stati modulati trasfettando SK-MEL-28 con un siRNA progettato per colpire tutte e quattro le isoforme ABCB5 per un lungo periodo di tempo di 14 giorni, durante il quale le cellule sono state trasfettate ogni tre giorni. In questo modo, abbiamo studiato la stabilità a lungo termine dell'espressione ABCB5 nelle cellule SK-MEL-28. È stata utilizzata una Real Time -PCR per analizzare l'espressione di ABCB5 a livello di mRNA e abbiamo dimostrato una trasfezione riuscita, ottenendo un valore di silenziamento per l'mRNA di ABCB5 del 93% dopo 14 giorni. Tuttavia, un western blot ha rivelato che la proteina ABCB5 è rimasta inalterata dopo la lunga trasfezione, come avevamo precedentemente osservato con una breve trasfezione di tre giorni, in condizioni di denaturazione lieve o forte. Infine, ha dimostrato un’analisi di immunofluorescenza con lo stesso anticorpo ABCB5, che ABCB5 non è confinato solo nella membrana cellulare ma può essere trovato in tutto il citoplasma cellulare. Questi risultati suggeriscono che i siRNA progettati possono silenziare efficacemente le isoforme ABCB5, sia dopo una trasfezione breve che lunga, mentre l'anticorpo utilizzato non è specifico per identificare la proteina ABCB5 e verificare gli effetti di silenziamento dei siRNA.
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Abstract
In the latest few decades, therapies based on stem cells have been in rapid evolution and progress. An example of a validated clinical approach based on stem cells potential is the autologous cultivated limbal epithelial transplantation (CLET), developed for the treatment of limbal stem cell deficiency (LSCD) and commercialised as Holoclar®. LSCD is a rare condition causing significant corneal opacification, vascularization and scarring, often resulting in serious visual impairment. Pellegrini et al. demonstrated that autologous transplantation of cultivated limbal stem cells (CLET) obtained from a 1-2 mm2 limbal biopsy could restore the corneal surface in patients suffering from total LSCD, with a success rate of 76.6%. Limbal stem cells are adult stem cells located in the limbus, the corneal epithelial stem cell niche, and they ensure a continual renewal of the corneal epithelium in case of damage. Several limbal stem cells biomarkers have been investigated but only one has been clinically validated, Np63 alpha. Another marker has been proposed, ABCB5 [ATP-binding cassette, subfamily B (MDR/TAP), member 5], a plasma membrane protein and human P-glycoprotein family member, shown to be overexpressed by cancer stem cells (CSC) in diverse human malignancies and associated with clinical tumour progression, therapeutic resistance, and recurrence in patients with cancer. ABCB5 was first identified as a marker of skin progenitor cells and melanoma stem cells, functioning as a regulator of cellular differentiation. Based on the latter properties, Ksander et al. hypothesized that ABCB5 might also identify slow cycling, label retaining limbal stem cells in the eye. Analysing ABCB5 protein expression in the limbus of either human or mice cells, they suggested ABCB5 as a maker of limbal stem cells. In this thesis, we have investigated the expression and stability of ABCB5 in a cell line deriving from melanocytes, SK-MEL-28 cells, presenting a high ABCB5 expression. ABCB5 expression levels have been modulated by transfecting SK-MEL-28 with a siRNA designed to target all four ABCB5 isoforms for a long period of time of 14 days, during which the cells have been transfected every three days. In this manner, we investigated the long-term stability of ABCB5 expression in SK-MEL-28 cells. A Real Time -PCR has been used to analyse the ABCB5 expression at mRNA level and we have demonstrated a successful transfection, obtaining a silencing value for ABCB5 mRNA of 93% after 14 days. However, a western blot assay revealed that ABCB5 protein remained unaltered after the long transfection, as we had previously observed with a short transfection of three days, either in mild or strong denaturing conditions. Finally, an immunofluorescence analysis with the same antibody showed that ABCB5 is not only confined to the cell membrane but could be found across the whole cell cytoplasm. These results suggest that the designed siRNAs can efficiently silence the ABCB5 isoforms, either after a short or a long transfection, while the antibody used is not specific for identifying ABCB5 protein and verify the siRNA silencing effects.
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