Riassunto analitico
Lonp1 è una proteasi mitocondriale, codificata a livello nucleare, molto conservata durante l’evoluzione. Lonp1 è stata definita una serin proteasi e la sua attività proteolitica assume un ruolo importante nella risposta alle proteine mitocondriali non ripiegate. Lonp1 presenta anche un’attività di chaperone, che ha un ruolo importante nell’apoptosi perché interagisce con p53 in condizioni di stress ossidativo. Infine, Lonp1 è molto importante per il mantenimento del mtDNA e per la regolazione del suo numero di copie. L’espressione di Lonp1 è ubiquitaria nei tessuti umani e l’analisi della distribuzione nei compartimenti mitocondriali mostra che il 90% si trova nella matrice in forma solubile. Perciò, la down-regolazione di Lonp1 porta ad una deplezione del mtDNA e ad un aumento della suscettibilità cellulare a stress quali l’ipossia e lo stress ossidativo. L’aumento di Lonp1 influenza varie tipologie di cancro come cancro al polmone, alla mammella, al pancreas, leucemia, neuroglioma e cancro colorettale metastatico (CRC). Inoltre, mutazioni di Lonp1 risultano associate ad una rara malattia autosomica recessiva multi-sistemica chiamata CODAS. Precedentemente si pensava che Lonp1 fosse localizzato esclusivamente nei mitocondri, ma recentemente abbiamo osservato che il 10-22% di Lonp1 è presente nel nucleo. I dati derivanti dai nostri studi suggeriscono che questo aumento di Lonp1 nel nucleo si ha in risposta all’heat shock e che nel nucleo Lonp1 interagisce con l’heat shock factor-1 (HSF-1). Tuttavia, il preciso ruolo di Lonp1 nel nucleo e la conseguenza dell’interazione con HSF-1 sono ancora sconosciuti. Abbiamo ipotizzato che questa interazione possa modificare la risposta all’heat shock mediata da HSF-1. Lo scopo della tesi è analizzare l’effetto di Lonp1 a livello trascrizionale in risposta all’heat shock. Per studiare questo effetto, cellule SW620 di cancro colorettale metastatico sono state incubate per un’ora a 42°C dopo aver silenziato Lonp1 con small interference RNA (siRNA), è stato poi estratto l’RNA ed è stata eseguita l’analisi di RNA-Seq. Il trascrittoma è stato confrontato con i controlli nei quali Lonp1 non è stato silenziato. I dati di RNA-Seq rivelano che nelle cellule dove è stato silenziato Lonp1 i geni up-regolati in condizioni di HS in gran parte si sovrappongono a quelli up-regolati nelle cellule usate come controllo, ma 125 di questi (il 25%) risultano up-regolati solo quando Lonp1 è silenziato, indicando che il silenziamento di Lonp1 modifica la risposta all’HS. È stato osservato un arricchimento significativo dei geni correlati alle seguenti pathways: regolazione della risposta all’HS mediata da HSF-1, trans-attivazione mediata da HSF-1 e attivazione di HSF-1. I geni target di HSF-1 mostrano un’espressione leggermente più alta nei campioni sottoposti all’HS dove Lonp1 è stato silenziato, se si fa una comparazione con i controlli. Nove di questi geni sono stati selezionati per la successiva analisi di Real-time PCR quantitativa fatta per confermare i risultati di RNA-Seq: HSPA6, HSPA1A, HSPA1L, ATF3, HSP90AA1, RAB30, HSPA4, TGFBR3, CREB3L3. Abbiamo confermato l’aumento significativo dell’espressione di sei geni su nove in condizioni di HS e con Lonp1 silenziato, per gli altri geni l’espressione non è risultata significativamente diversa. Questa analisi suggerisce che, in condizioni di HS, Lonp1 si rilocalizza nel nucleo, dove interagisce con HSF-1 probabilmente per degradarlo e modulare la risposta all’HS. Dopo la fosforilazione, HSF-1 può traslocare nel nucleo e promuovere la trascrizione delle proteine dell’HS che sono coinvolte nel ripiegamento e nella degradazione delle proteine intracellulari danneggiate. In conclusione, si può affermare che le proteine dell’HS risultano up-regolate in condizioni di heat shock.
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Abstract
Lonp1 is a nuclear-encoded mitochondrial protease highly conserved throughout evolution. Lonp1 has been identified as a serine protease and its proteolytic activity has a key role in the mitochondrial unfolded protein response (UPRmt). Lonp1 shows also a chaperone activity, which has an important role in apoptosis because it interact with p53 under oxidative stress. Finally, Lonp1 is very important for mtDNA maintenance and for the regulation of its copy number. Lonp1 is expressed ubiquitously in human tissues and the analysis of Lonp1 distribution in submitochondrial compartments of human cells shows that almost 90% is soluble in the matrix. Therefore, Lonp1 down-regulation leads to mtDNA depletion and to the increase of the sensitivity to hypoxia and oxidative stress damage. The increase of Lonp1 has been shown to be involved in different types of cancer as lung, bladder, breast cancer, pancreatic cancer, leukemia, brain cancer (glioma) and metastatic colorectal cancer (CRC). In addition, mutations of Lonp1 are associated with a rare multi-system autosomal recessive disease called CODAS.
Lonp1 was previously believed to be exclusively located in the mitochondria, but we recently observed that 10-22% of Lonp1 is present in the nucleus. Data from our lab strongly suggest that the amount of nuclear Lonp1 increases in response to heat shock, and that in the nucleus Lonp1 interacts with Heat Shock Factor-1 (HSF1). However, the role of Lonp1 in the nucleus and the consequences of its interaction with HSF1 are unknown. We hypothesized that Lonp1 interaction with HSF1 can modify the modulation of Heat shock response by HSF1.
Accordingly, the aim of the thesis is to analyze the effects of Lonp1 in heat shock response at transcriptional level. To study this effect, SW620 metastatic colorectal cancer cells have been incubated for one hour at 42°C after silencing Lonp1 with a small interfering RNA (siRNA), RNA has been extracted and RNA-seq has been performed. Transcriptome has been compared with control cell, i.e. cells undergoing HS, without silencing of Lonp1.
RNA-Seq data analysis showed genes up-regulated during HS in Lonp1-silenced cells are largely overlapping with those upregulated in control cells, but 125 of them (25%) are uniquely upregulated when Lonp1 was silenced, indicating that silencing of Lonp1 modified HS response.
A significant enrichment of genes related to “regulation of HSF1 mediated HS response”, “HSF1 dependent transactivation” and “HSF1 activation” pathways was observed. HSF1 target genes showed a slightly higher expression in samples under HS where Lonp1 was silenced, if compared to control cells. Nine of these genes have been selected for the subsequent quantitative Real-time PCR to confirm RNA-Seq results: HSPA6, HSPA1A, HSPA1L, ATF3, HSP90AA1, RAB30, HSPA4, TGFBR3, CREB3L3. We confirmed significantly higher expression in Lonp1 silenced cells undergoing HS for six out of nine genes; in the case of the other genes, expression was not significantly different.
This analysis suggests that in heat shock conditions Lonp1 relocates to the nucleus, where interacts with HSF1, probably to degrade it and modulates the heat shock response. After phosphorylation HSF1 can translocate into the nucleus to promote the transcription of heat shock proteins, which are involved in the refolding or degradation of damaged intracellular proteins, and in particular heat shock proteins are up-regulated in heat shock conditions.
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