Riassunto analitico
L’ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica umana (hCG) sono ormoni glicoproteici che regolano la riproduzione. LH e hCG agiscono legandosi allo stesso recettore, LHCGR, espresso sulla membrana plasmatica delle cellule della granulosa nell’ovaio, e delle cellule di Leydig nel testicolo. Il legame tra hCG e LH con LHCGR determina l’attivazione di diverse vie di trasduzione del segnale intracellulare, mediate dalle proteine Gαs, Gαi, e Gαq e dalle β-arrestine. Lo scopo dello studio è di confrontare la cinetica di attivazione delle proteine G e il reclutamento della β-arrestina 2 mediati da hCG e LH. Anche l'attivazione di cAMP e l’aumento di ioni calcio (Ca2+) a livello intracellulare, e la fosforilazione di extracellularly-regulated kinases 1 e 2 (ERK1/2) verranno valutate in vitro.
Human embryonic kidney cells 293 (HEK-293) sono state trasfettate in maniera transiente con plasmidi aventi il gene codificante LHCGR e specifici biosensori. Le cellule sono state stimolate con dose fissa di LH e hCG, in presenza e in assenza di un inibitore dell’internalizzazione del recettore (Dynasore). La cinetica di attivazione dei suddetti endpoints intracellulari è stata valutata mediante metodica bioluminescence resonance energy transfer (BRET), per 20 minuti.
I risultati dimostrano che hCG induce efficacemente l'accoppiamento di LHCGR a proteine Gαs, Gαq e β-arrestina 2, mentre LH con la proteina Gαi. Inoltre, i dati indicano che l’associazione tra recettore e Gαs, Gαq e Gαi, indotta da LH, dipende dall'internalizzazione del recettore poiché è inibita dal Dynasore. Invece, ciò non avviene in seguito a trattamento cellulare con hCG. Questi dati mostrano una stretta correlazione con la cinetica di attivazione dei secondi messaggeri. LH induce un rapido (5-10 min) aumento dell’accumulo di cAMP intracellulare, rispetto all’hCG, la quale invece induce il raggiungimento dello stesso plateau in 10-20 min. Inoltre, LH è più potente di hCG nell'attivare la fosforilazione di ERK1/2 per 20 min (AUC; p<0,05), funzione dipendente dall’internalizzazione di LHCGR. hCG induce aumento di Ca2+ intracellulare in maniera relativamente lenta, raggiungendo il plateau in 150 s, mentre diventa molto più rapido e costante in presenza di Dynasore. Al contrario, LH non induce alcun aumento di Ca2+ intracellulare. Questi dati dimostrano che hCG attiva le proteine Gαs, Gαq e le β-arrestine 2 in seguito al legame con LHCGR, mentre LH induce un rapido aumento di cAMP intracellulare e fosforilazione di ERK1/2 in maniera dipendente dall'internalizzazione del recettore.
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Abstract
L’ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica umana (hCG) sono ormoni glicoproteici che regolano la riproduzione. LH e hCG agiscono legandosi allo stesso recettore, LHCGR, espresso sulla membrana plasmatica delle cellule della granulosa nell’ovaio, e delle cellule di Leydig nel testicolo. Il legame tra hCG e LH con LHCGR determina l’attivazione di diverse vie di trasduzione del segnale intracellulare, mediate dalle proteine Gαs, Gαi, e Gαq e dalle β-arrestine. Lo scopo dello studio è di confrontare la cinetica di attivazione delle proteine G e il reclutamento della β-arrestina 2 mediati da hCG e LH. Anche l'attivazione di cAMP e l’aumento di ioni calcio (Ca2+) a livello intracellulare, e la fosforilazione di extracellularly-regulated kinases 1 e 2 (ERK1/2) verranno valutate in vitro.
Human embryonic kidney cells 293 (HEK-293) sono state trasfettate in maniera transiente con plasmidi aventi il gene codificante LHCGR e specifici biosensori. Le cellule sono state stimolate con dose fissa di LH e hCG, in presenza e in assenza di un inibitore dell’internalizzazione del recettore (Dynasore). La cinetica di attivazione dei suddetti endpoints intracellulari è stata valutata mediante metodica bioluminescence resonance energy transfer (BRET), per 20 minuti.
I risultati dimostrano che hCG induce efficacemente l'accoppiamento di LHCGR a proteine Gαs, Gαq e β-arrestina 2, mentre LH con la proteina Gαi. Inoltre, i dati indicano che l’associazione tra recettore e Gαs, Gαq e Gαi, indotta da LH, dipende dall'internalizzazione del recettore poiché è inibita dal Dynasore. Invece, ciò non avviene in seguito a trattamento cellulare con hCG. Questi dati mostrano una stretta correlazione con la cinetica di attivazione dei secondi messaggeri. LH induce un rapido (5-10 min) aumento dell’accumulo di cAMP intracellulare, rispetto all’hCG, la quale invece induce il raggiungimento dello stesso plateau in 10-20 min. Inoltre, LH è più potente di hCG nell'attivare la fosforilazione di ERK1/2 per 20 min (AUC; p<0,05), funzione dipendente dall’internalizzazione di LHCGR. hCG induce aumento di Ca2+ intracellulare in maniera relativamente lenta, raggiungendo il plateau in 150 s, mentre diventa molto più rapido e costante in presenza di Dynasore. Al contrario, LH non induce alcun aumento di Ca2+ intracellulare. Questi dati dimostrano che hCG attiva le proteine Gαs, Gαq e le β-arrestine 2 in seguito al legame con LHCGR, mentre LH induce un rapido aumento di cAMP intracellulare e fosforilazione di ERK1/2 in maniera dipendente dall'internalizzazione del recettore.
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