Riassunto analitico
Gli enzimi fosfodiesterasi 5 (PDE5) catalizzano l’idrolisi della guanosina mono-fosfato ciclico (cGMP), mediando il rilassamento della muscolatura liscia de corpi cavernosi del pene e l’erezione. Inibitori delle PDE5 (PDE5i), quali sildenafil, vardenafil e tadalafil, si legano alla sub-unità catalitica di PDE5 inducendo accumulo di cGMP intracellulare. Quindi, sono impiegati per la cura della disfunzione erettile.
Lo scopo di questo studio è validare un nuovo metodo di valutazione dell’interazione tra cGMP e PDE5 in vitro.
Cellule HEK293 e la linea tumorale murina di Leydig mLTC1 sono state trasfettate in trasiente con plasmide avente il cDNA della sub-unità catalitica di PDE5, fusa con una coda di tetracisteine (PDE5-tc), in grado di legare il fluoroforo “FlAsH” somministrato alle cellule. cGMP marcato con il fluoroforo rodammina (cROD) è quindi stato aggiunto alla coltura cellulare, che è stata sottoposta a irraggiamento con energia luminosa di lunghezza d’onda pari a 480nm. Tale trattamento induce l’emissione di energia luminosa da parte del fluoroforo FlAsH, il quale eccita a sua volta cROD, con conseguente emissione di energia luminosa della lunghezza d’onda di 605nm. Quest’ultimo segnale è rilevabile in caso di vicinanza spaziale tra FlAsH e cROD, indicante il legame tra PDE5 e cGMP. La subunità catalitica della PDE5 wild type (PDE5-wt), incapace di legare la FlAsH e quindi di generare FRET a seguito del legame con il cGMP, è stata utilizzata come controllo. L’interazione tra l’enzima e il cGMP è stata valutata mediante trasfezione di cDNA codificante PDE5-tc/wt in quantità fissa e stimolate con concentrazioni crescenti di cROD (range 1-30 µM). Esperimenti di spiazzamento di PDE5-cGMP sono stati eseguiti somministrando PDE5i a cellule trasfettate con quantità fisse di cDNA codificante cGMP-tc/wt e trattate con concentrazione fissa di cROD.
Nella linea cellulare HEK293, PDE5-tc è in grado di legare cROD somministrato in concentrazioni crescenti, quindi generando una curva di affinità dalla quale è stata estrapolata la costante di dissociazione (Kd), pari a 6.0 µM. Tale risultato è stato confermato nella linea mLTC1, ma con Kd=15.0 µM. Esperimenti di spiazzamento sono stati eseguiti utilizzando una dose efficace di cROD calcolata come la concentrazione immediatamente superiore a Kd, (9.0 µM e 18.0 µM in HEK293 e mLTC1, rispettivamente) in presenza di 0.5 µM sildenafil, vardenafil e tadalafil. Tutti gli inibitori hanno indotto lo spiazzamento di cROD da PDE5-tc entro 5 minuti, risultando nel decremento del segnale FRET. In particolare, sildenafil ha indotto il decremento del segnale FRET per 10 minuti, mentre gli altri PDE5i per soli 5 minuti.
In cellule mLTC1, tale metodo verrà utilizzato per associare l’attività, a livello molecolare, dei PDE5i con la produzione degli ormoni steroidei, progesterone e testosterone. Questo studio ha fornito un nuovo sistema per valutare gli eventi steroidogenici a livello intracellulare.
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