• coliche-gassose
• fermentazioni
• microbiota
• probiotici
• proteolisi

Gli argomenti di questo progetto di tesi hanno riguardato il rapporto fra il microbiota intestinale e funzioni associate allo stato di salute dell’uomo.
In un sistema modello in vitro di microbiota intestinale di un neonato di 2 mesi affetto da coliche è stata determinata l’inibizione della crescita delle Enterobacteriaceae da parte di Bifidobacterium breve B632, precedentemente selezionato per specifiche attività probiotiche. Sono state confrontate le quantità dei diversi gruppi microbici mediante FISH e qPCR in colture fecali condotte in parallelo addizionate o meno del ceppo probiotico.
Sulla base delle analisi di RAPD-PCR sui bifidobatteri isolati su terreno selettivo RB, B. breve B632 ha colonizzato le colture di microbiota intestinale rappresentando il 64% dei bifidobatteri totali allo stato stazionario. La concentrazione di Enterobacteriaceae dopo 18 ore di fermentazione, determinata mediante FISH e qPCR, era di 0.42 e 0.44 ordini di grandezza più bassa nelle colture addizionate del ceppo probiotico rispetto ai controlli (p < 0.05). Questi risultati sono estremamente promettenti e indicano la possibilità di proseguire la validazione del probiotico in vivo.
La seconda parte del progetto ha riguardato la caratterizzazione della popolazione batterica proteolitica di soggetti sani adulti. La fermentazione delle proteine produce, oltre ad ammonio ed acidi organici, alcuni metaboliti tossici noti come tossine uremiche: indolo e p-cresolo. In questo studio è stato impiegato un sistema modello in vitro nel quale sono state condotte fermentazioni fecali in un mezzo colturale nel quale erano disponibili proteine e peptidi come fonte di carbonio. L’attività proteolitica è stata confermata dall’accumulo in coltura di ammonio, indolo e p-cresolo, e dal profilo degli acidi organici prodotti. L’identificazione della componente proteolitica è stata determinata mediante sequenziamento degli amplificati del gene codificante l’RNA 16S. I processi fermentativi sono stati condotti utilizzando concentrazioni diverse di inoculo iniziale, onde conferire un vantaggio competitivo ai batteri presenti in quantità più elevate, o a quelli presenti alle concentrazioni più basse. Confrontando l’abbondanza relativa della coltura all’inizio del processo, dopo 6 e 12 ore è stato osservato un aumento in particolare di batteri appartenenti all’ordine dei Clostridiales e alla classe dei Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria e Gammaproteobacteria. E’ bene considerare che la maggior parte dei gruppi microbici identificati è a livello di genere o di cluster. Questo studio necessita quindi di una ulteriore validazione funzionale condotta su colture singole riferibili a specie ben precise.
Nell’ultima parte di questo progetto di tesi è stata studiata la composizione chimica e microbiologica delle feci di due coorti composte da 10 soggetti sani ed 8 pazienti affetti da insufficienza renale cronica. Il pH era significativamente più alto nei pazienti rispetto ai volontari sani, mentre per ammonio, indolo e p-cresolo non è stata osservata alcuna differenza. Le concentrazioni dei carboidrati sono risultate più alte nelle feci dei pazienti rispetto ai sani. Sui medesimi campioni relativi alla coorte dei volontari sani sono state condotte prove di trasformazione di indolo e p-cresolo e verso indolo e p-cresolo (a partire dai precursori triptofano e tirosina) mediante esperimenti con resting cells. Il p-cresolo è molto recalcitrante e viene scarsamente degradato, mentre la trasformazione dell’indolo sembra indotta dalla presenza di elevate concentrazioni dello stesso. Entrambi i metaboliti si accumulano velocemente in presenza dei precursori triptofano e tirosina.

The main topics of this thesis project concerned the relationship between the intestinal microbiota and the functions associated to the human health status. In an in vitro model system of intestinal microbiota it was determined the inhibition of the Enterobacteriaceae growth caused by the Bifidobacterium breve B632 strain, previously selected for its specific probiotic activities. Two groups of fecal cultures were carried out in parallel. One of them is composed by the fermentative processes employing the fecal sample of a 2 months old newborn as inoculum. The second one was performed adding to the fecal culture the probiotic strain. The concentrations of the different microbial groups have been compared through FISH and qPCR. Based on the RAPD-PCR results concerning the bifidobacteria isolated on RB selective medium, B. breve B632 colonized the intestinal microbiota cultures representing the 64% of the total bifidobacteria at the steady state. After 18 h of fermentation the Enterobacteriaceae concentration, determined through FISH and qPCR, was of 0.42 and 0.44 order of magnitude lower into the cultures supplemented with the probiotic than the controls ones (p < 0.05). This results are promising and suggest the possibility to proceed to the probiotic validation in vivo. The second part of the project regarded the characterization of the proteolytic bacterial population in healthy adults. The proteins fermentation produces, in addition to ammonium and organic acids, also some toxic metabolites known as uremic toxins: indole and p-cresol. In this study, in an in vitro model system, fecal fermentations have been carried out in a medium containing only proteins and peptides as carbon source. The proteolytic activity has been confirmed by the accumulation of the ammonium, indole and p-cresol and by the organic acid profile produced. The identification of the proteolytic component of the microbiota has been determined through the sequencing of the amplicones of the gene encoding for the 16S RNA. The fermentations have been carried out using different concentrations of the initial inoculum in order to give a competitive advantage to the bacteria present in higher concentration or to those present at lower concentration. Comparing the culture relative abundances at the beginning of the process and after 6 and 12 h it was observed an increase of the bacteria belonging to the Clostridiales order and to the Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria and Gammaproteobacteria class particularly. It is important to observe that the majority of the bacterial groups is identified at genus or cluster level. For this reason this study needs further functional validation carried out on pure cultures that can be reported to precise species. In the last part of this project it was studied the chemical and microbiological composition of the feces of two cohorts composed of 10 healthy subjects and 8 patients affected by chronic kidney disease. The pH was significantly higher into the patients groups than the healthy ones, while for the ammonium, indole and p-cresol differences were not observed. The carbohydrates concentrations were higher in the feces of the patients than in those of the volunteers. On the same samples related to the healthy volunteers cohort, the transformation of the indole and p-cresol and the transformation of their precursors (tryptophan and tyrosine) into indole and p-cresol through experiments with resting cells have been carried out. The p-cresol is recalcitrant and it is barely degraded, while the indole transformation seems to be induced by the presence of the higher concentrations of the same metabolite. Both metabolites were quickly accumulated in the presence of the precursors tryptophan and tyrosine.