Riassunto analitico
La riproduzione sessuale aumenta la variabilità genetica sottoposta a selezione naturale in condizioni ambientali sfavorevoli. I lieviti del complesso Zygosaccharomyces rouxii sono microrganismi coinvolti nell’elaborazione e nel deterioramento degli alimenti, grazie alla loro resistenza a stress osmotici. Si riproducono sia per via sessuale (Z. rouxii) che clonale (Zygosaccharomyces sapae), hanno variabilità cromosomica e nel grado di ploidia e mostrano duplicazione genica ed eterogeneità dell’rDNA. Tale variabilità genetica porta a diversità fenotipica e adattamento ad ambienti ostili attraverso ricombinazione ectopica dei mating-type loci (MTL) in un meccanismo di switching “error-prone”. All’interno del complesso è stato identificato un ceppo allopoliploide, ATCC42981, che è incapace di riproduzione sessuale e mostra eterosi e tolleranza a differenti tipi di stress. Il presente studio si propone di indagare l’organizzazione genica e l’espressione trascrizionale dei loci MTL e dell’endonucleasi HO nel ceppo ATCC42981. Mediante PCR walking basato sulle sequenze MTL di Z. rouxii e Z. sapae si è dimostrato che ATCC42981 possiede 2 copie divergenti MTLalpha (MTLalpha copia 1 e 2), codificanti per proteine omologhe a MATalpha2 e MATalpha1 di, rispettivamente, Z. rouxii e Z. sapae. ATCC42981 possiede tre differenti loci MTLa, chiamati copia 1, 2 e 3, ciascuno dei quali contiene un’ORF MATa1 identica a quella di Z. rouxii e un diverso gene MATa2. L’analisi delle regioni fiancheggianti ai loci MTL ha evidenziato che le copie 2 di MTLa e MTLalpha hanno un’organizzazione DIC1-MAT-SLA2, canonica per i loci MAT trascrizionalmente espressi. In aggiunta sono state identificate quattro cassette silenti: tre a-idiomorfe (DIC1-HMR copia 1, CHA1-HMR copia 2 e CHA-HMR copia 3) ed una alpha-idiomorfa HML copia 1. Pertanto il ceppo ATCC42981 ha un genotipo a/alpha con un sovrabbondante numero di cassette silenti HMR. Inoltre, come Z. sapae, ATCC42981 è dotato di due copie divergenti del gene HO (copia 1 e 2), entrambe codificanti l’endonucleasi che catalizza il taglio “double-strand “nel locus MAT, essenziale per lo switching del mating-type. L’analisi trascrizionale dei geni identificati in questo studio mostra che, coerentemente all’organizzazione genica, le copie 2 dei geni MATa1 e MATalpha2 sono espresse in condizioni di crescita standard, mentre entrambe le copie 1 di MATalpha1 e MATalpha2 (cassette HML) sono silenti. Questo implica la presenza in ATCC42981 di un eterodimero ibrido composto di una subunità a1 Z. rouxii-like e una subunità alpha2 Z. sapae-like. Nei ceppi diploidi di Saccharomyces cerevisiae l’eterodimero a1/alpha2 agisce come un repressore dei geni aplodi-specifici, quali MATalpha1 e HO, e consente alle cellule diploidi a/alpha di sporulare. Tuttavia questo circuito regolatore sembra non essere completamente funzionante in ATCC42981 che è incapace sia di sporulare che di reprimere completamente la trascrizione dei geni MATalpha1 e HO. Siccome lo stress salino induce la meiosi in Zygosaccharomyces mediante l’attivazione dei geni aploidi-specifici sotto il controllo dei fattori trascrizionali MAT, abbiamo quantificato l’espressione in condizioni iperosmotiche dei geni clonati. L’analisi RT-qPCR ha rilevato che, mentre la trascrizione della copia 1 del gene HO rimane invariata, HO copia 2, MATalpha1 copia 2 e MATa1 copia 2 risultano over-espresse. Sulla base dei risultati ipotizziamo che l’eterodimero “ibrido” a1/alpha2 sia inefficace nel silenziare sia il set di geni aploidi-specifici che i fattori inibenti la meiosi. Questo spiegherebbe perché ATCC42981 si riproduca esclusivamente per via clonale. In un ceppo allodiploide l’espressione costitutiva dei geni aploidi-specifici MATalpha1 e HO e la loro positiva regolazione trascrizionale in risposta a stress salino rappresentano un risultato interessante che si presta a futuri approfondimenti.
|
Abstract
Sex increases genetic variation that is strongly selected under harsh environmental conditions allowing natural selection to proceed more effectively. Yeasts belonging to the Zygosaccharomyces rouxii complex are relevant microorganisms in foodstuff elaboration and spoilage due to a wide repertoire of tolerances to osmotic stress. This group includes both sexual (Z. rouxii) and asexual (Zygosaccharomyces sapae) yeasts showing chromosome variability, gene duplication, ploidy variation, and rDNA heterogeneity. Their genetic variation favors phenotypic diversity and adaptation to hostile environments by ectopic recombination of mating-type (MTL) loci in an error-prone switching mechanism. Among them, we identified a mosaic allopolyploid strain ATCC42981, which exhibits hybrid vigor and tolerance to multi-stress, but which is unable to undergo sexual reproduction. The aim of the present study is to disclose the genetic architecture and the transcriptional expression of sex determinants, including MTL loci and HO gene, in ATCC42981 strain. Firstly we characterized the gene content and the organization around MTL. PCR walking strategy based on Z. rouxii and Z. sapae MTL sequences showed that ATCC42981 possesses two divergent MTLalpha loci (MTLalpha copies 1 and 2), encoding proteins homologous to MATalpha2 and MATalpha1 of Z. rouxii and Z. sapae, respectively. Moreover, ATCC42981 has three divergent MTLa loci, namely MTLa copies 1, 2, and 3, each of them containing a Z. rouxii MATa1 ORF and a divergent MATa2 gene. The analysis of flanking regions indicated that MTLa and MTLalpha copies 2 exhibited the DIC1-MAT-SLA2 gene array, canonical for MAT expression loci. Furthermore, three silent a-idiomorph cassettes, i.e. DIC1-HMRa copy 1, CHA1-HMRa copy 2, and CHAL-HMRa copy 3, and one silent alpha-idiomorph cassette HMLalpha copy 1 were identified. On the basis of these results, strain ATCC42981 displays a/alpha genotype with a redundant number of the HMR silent cassettes. Secondly we sequenced the ATCC42981 HO genes, which encode the endonuclease catalyzing the double strand break at MAT locus required for mating type switching. Since ATCC42981 was unable to perform outcrossing with heterothallic mating tester strains, its sexual cycle, if present, may be dependent on the ability to express HO gene and perform haplo-selfing. Like Z. sapae, allodiploid strain possesses two divergent HO genes (copies 1 and 2). Finally, we studied the transcription of MATalpha, MATa and HO genes. Preliminary RT-PCR confirmed that, consistently with the gene organization, MATa1 and MATalpha2 copy 2 genes are expressed under standard conditions (no stress), whereas MATalpha1 and MATalpha2 copy 1 (from HML cassette) are silent. In Saccharomyces cerevisiae diploids, the a1/alpha2 protein heterodimer acts as a repressor of haploid-specific genes, such as MATalpha1 and HO genes, and allows a/alpha diploid cells to undergo sporulation. However, this regulatory circuit is not effective in ATCC42981 strain, which does not repress either MATalpha1 or HO genes transcription. As salt induces sporulation in Zygossaccharomyces cells through the activation of haploid gene-specific programs under control of MTL, we quantified transcriptional level of cloned genes under hyperosmotic stress. While the transcription of HO copy 1 was unchanged, HO copy 2, MATa1/MATalpha2 copy 2 and MATalpha1 copy 2 were over-expressed. The reason why the haploid specific genes MATalpha1 and HO are expressed in allodiploid yeast and their transcriptions respond differently to the salt stress is still intriguingly. We can assume that the partial incompatibility between Z. rouxii-like a1 and Z. sapae-like alpha2 subunits in MATa1/alpha2 heterodimer causes a defective silencing of haploid-specific genes, including meiosis inhibiting factors, leading to clonality as the only possible reproduction strategy for ATCC42981.
|
