Riassunto analitico
L’aromatasi è un membro della famglia dei citocromi P450 e contiene quindi un gruppo eme nel quale un atomo di ferro trasferisce elettroni attraverso reazioni di ossidoriduzione. Questo enzima è stato ampiamente studiato poiché catalizza la conversione degli androgeni in estrogeni attraverso tre reazioni di idrossilazione consecutive, in accoppiamento col suo partner redox citocromo P450 reduttasi. Nell’ uomo gli estrogeni sono sintetizzati in diversi tessuti e giocano un ruolo fondamentale nello sviluppo del cancro al seno: i recettori degli estrogeni, infatti, attivano la trascrizione di geni target che sono responsabili della proliferazione tumorale nei tumori al seno estrogeno dipendenti. Per questo motivo gli inibitori dell’aromatasi sono stati usati per anni nella pratica clinica al fine di ridurre i livelli di ormoni, ma il numero di pazienti resistenti alle terapie standard aumenta costantemente. Nel panorama sperimentale è stato ottenuto il modello di docking dell’aromatasi con un suo inibitore, l’anastrozolo, in cui questo coordina il ferro attraverso legami di coordinazione tra N e Fe. Dal punto di vista elettrochimico il legame dell’inibitore cambia la sfera di coordinazione del metallo e questo provoca un cambiamento dei valori di potenziale che può essere monitorato attraverso analisi di voltammetria ciclica. L’elettrodo su cui la proteina viene immobilizzata per condurre questi esperimenti ha la funzione di rimpiazzare, in vitro, il sistema donatore/accettore, risultando molto interessante per applicazioni di high-throughput screening di nuovi farmaci. Nonostante la proteina sia stata ben caratterizzata, la maggior parte degli studi sono stati fatti sull’enzima in soluzione, ma il comportamento sulla superficie di un elettrodo non è stato ancora chiarito. Lo scopo di questo lavoro di tesi è di determinare il potenziale redox standard dell’enzima immobilizzato sulla superficie di un elettrodo d’oro per determinare il suo comportamento nella forma nativa, con un suo substrato naturale, l’androstenedione e con un suo inibitore, l’anastrozolo, attraverso tecniche di voltammetria ciclica e ad onda quadra.
|
Abstract
Aromatase is a member of cytochrome P450 superfamily, hence it contains an iron heme cofactor that can undergo oxidation or reduction, transferring electrons. This enzyme has been extensively studied because catalyzes the conversion of androgens to the biologically active estrogens in a three step process, coupling with its redox partner cytochrome P450 reductase. In humans estrogens are synthetized in many tissues and play an important role in breast cancer development; their receptors activate transcription of target genes, which are responsible for cancer cell proliferation in estrogen-dependent breast tumors. Therefore inhibitors of Aromatase activity have been used for years in cancer therapy in order to decrease estrogens levels, but the number of patients resistant to standard drugs rise constantly. The docking model of human aromatase-anastrozole shows that the anastrozole coordinates the heme through a N-Fe bond. From an electrochemical point of view, the bond between the inhibitor and the metallic centre causes changes in the metal coordination sphere, resulting in significant E°' changes, which can be revealed by voltammetric experiments. The electrode, on which proteins are immobilized on, has the function to replace, in vitro, the electron donor/acceptor and this makes the application of electrochemical methods a very attractive strategy for the construction of a reagent-less platform for high-throughput screening of new drug candidates. Although the protein has been well characterized, most of the studies has been focused on the enzyme in solution; far to be clear is its behavior on solid surface. The aim of this study is to determine the redox potential of the enzyme immobilized on a gold surface electrode; in particular of the native enzyme, of the enzyme with androstenedione and of the complex aromatase-anastrozole through cyclic and square wave voltammetry techniques.
|