• Brewing
• Hybridization
• POF phenotype
• S. cerevisiae
• UV mutagenesis

Le birre lager, rinomate per il loro profilo aromatico e la popolarità globale, sono tradizionalmente prodotte utilizzando Saccharomyces pastorianus, derivante dall’ibridazione spontanea tra Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces eubayanus, combinando l’efficienza fermentativa del primo con la tolleranza al freddo del secondo. Tuttavia, i lieviti lager convenzionali sono una risorsa limitata con poche variazioni genetiche e fenotipiche. Per rispondere alla crescente domanda di profili aromatici innovativi, è essenziale sviluppare nuovi lieviti per la birrificazione. Ceppi selvatici provenienti da nicchie naturali alternative all’ambiente brassicolo hanno dimostrato di fermentare con successo il mosto, ma spesso presentano sfide, come la produzione di off-flavors fenolici (POF), come il 4-vinil guaiacolo (4VG), tramite la decarbossilazione dell’acido ferulico. Pertanto, sono necessarie tecniche non OGM come l’ibridazione e la mutagenesi casuale per ottimizzare nuovi starter di lievito.

In questo studio, abbiamo sviluppato un ceppo ibrido sintetico che imita i lieviti lager, incrociando colture monosporiche di S. cerevisiae Y15, isolato da pasta acida, con colture monosporiche di S. eubayanus NBRC1948. Il metodo di ibridazione spore-to-spore prevede la sporificazione in carenza di carbonio e azoto, seguita dalla digestione enzimatica degli asci con zimolasi e dissezione tramite micromanipolatore. Un candidato ibrido, FM1, è stato confermato tramite PCR specie-specifica e analisi dei frammenti di restrizione della regione ribosomiale 5.8S-ITS. Il fenotipo POF⁺ dell'ibrido è stato caratterizzato utilizzando l’Indice di Conversione dell’Acido Ferulico (FACI), indicativo della conversione dell’acido ferulico (FA) in 4-VG, e l’Indice di Sensibilità all’Acido Cinnamico (CASI), che indica l’inibizione della crescita in rpesenza di acido cinnamico (CA). I saggi hanno confermato il fenotipo POF⁺.
Per eliminare il fenotipo POF⁺, è stata eseguita una mutagenesi casuale tramite irradiazione UV, ottimizzando parametri come la sorgente di luce UV, il tempo di esposizione e l’uso dell’agente antifungino nistatina. La mortalità risultava tra l'8% e il 22% con una lampada UV a 50 cm dalla piastra e un tempo di esposizione di 30 secondi. I mutanti sono stati selezionati su YPDA con 4 mM di acido ferulico. I tassi di successo sono stati del 13.3% senza nistatina e dello 0.4% con nistatina e, dei mutanti ottenuti, il 5.8 % esibiva una ridotta crescita in acido ferulico. Il mutante FM1.45 ha mostrato una significativa riduzione del FACI e un aumento del CASI, indicando una diminuzione del fenotipo POF⁺. La riduzione della conversione di FA in 4-VG è stata validata tramite spttrometria di massa del supernatante ottenuto dopo 72 ore di crescita in un mezzo contente 1mM di FA.
La microfermentazione ha rivelato che FM1 e FM1.45 hanno migliorato le prestazioni fermentative rispetto ai parentali. L’analisi citometrica ha determinato un aumento della ploïdia del mutante FM1.45 rispetto a FM1 e un notevole aumento della vitalità sporale, dallo 0% al 16%, indicando la risoluzione delle barriere post-zigotiche.
In conclusione, questo studio dimostra che l’ibridazione e la mutagenesi UV sono una strategia non OGM utile per creare nuovi ceppi di lievito per la birrificazione con migliori prestazioni fermentative e tratti desiderabili.

Lager beers, renowned for their clean flavor profile and global popularity, have traditionally been brewed using Saccharomyces pastorianus. This yeast originated from the natural hybridization of S. cerevisiae and S. eubayanus, combining the fermentation efficiency of Saccharomyces cerevisiae with the cold tolerance of Saccharomyces eubayanus. However, conventional lager yeasts are a restricted pool of genetically and phenotypically poorly variable strains. To address the growing consumer demand for innovative and complex aromatic profiles, it is essential to develop novel brewing yeast starters. Wild strains from natural niches alternative to the brewing environment have been proved to successfully ferment wort but often present challenges, such as the production of phenolic off-flavors (POFs), such as 4-vinyl guaiacol (4VG), through the decarboxylation of ferulic acid, a trait which hampers their usage at real scale. Therefore, GMO-free techniques like random hybridization and random mutagenesis are required to improve and optimize novel brewing yeast starters. In this study, we developed a new synthetic hybrid strain which mimics lager yeasts, by mating monosporic cultures of the sourdough S. cerevisiae Y15 strain and monosporic cultures of S. eubayanus NBRC1948 strain. The spore-to-spore hybridization method entailed the sporulation under carbon and nitrogen starvation, followed by enzymatic digestion of asci with zymolyase and their mechanical dissection using a micromanipulator. A hybrid candidate, FM1, was successfully obtained and confirmed through species-specific PCR and restriction fragment analysis of the 5.8S-ITS ribosomal region. The POF⁺ phenotype of the hybrid was characterized using two spectrophotometric assays: the Ferulic Acid Conversion Index (FACI), indicative of ferulic acid conversion to 4VG, and the Cinnamic Acid Sensitivity Index (CASI), indicative of growth inhibition in the presence of cinnamic acid. These assays confirmed the POF⁺ phenotype of the hybrid. To eliminate the POF⁺ phenotype, random mutagenesis was performed via UV irradiation. Parameters such as the UV light source, exposure time, and the use of the antifungal agent nystatin, which promotes the growth of slow-growing mutated cells, were optimized to balance cell mortality and mutation efficiency. A mortality rate between 8% and 22% was achieved with a UV lamp positioned 25 cm from the plate and an exposure time of 30 seconds. Mutants were screened on YPDA medium supplemented with 4 mM ferulic acid. Success rates of random mutagenesis were 13.3% without nystatin treatment and 0.4% with nystatin. Among the mutants obtained, 5.8% exhibited reduced growth in the presence of ferulic acid. The mutant FM1.45 displayed a statistically significant reduction in the FACI and an increase in the CASI, indicating a decreased POF+ phenotype. The reduction in ferulic acid conversion to 4VG was further validated through mass spectrometry analysis of the supernatant obtained after 72 h of growth in ferulic acid-supplemented medium. Wort microfermentation, using parental strains and the original hybrid as controls, revealed that both FM1 and FM1.45 outperformed the parental strains in fermentation performance. Cytometric analysis determined an increased ploidy of the mutant hybrid FM1.45 compared to the original one FM1 and a notable increase in spore viability from 0% to 16%, which indicates a resolution of post-zygotic barriers. In conclusion, this study demonstrates that the combination of hybridization and UV mutagenesis is an useful non-GMO strategy for creating novel brewing yeast strains with improved fermentation performance and desirable traits.