Riassunto analitico
La metabolomica è un approccio di ricerca che si sta espandendo sempre più nell'ultimo decennio e può essere applicata a matrici diverse, come quella fecale, per l'analisi del microbiota. Il microbiota intestinale può essere descritto come un organismo microbico collocato all'interno di un ospite ed è probabilmente all'intersezione di tutte le condizioni fisiologiche o patologiche, come l'allergia. In questo caso, il microbiota favorisce la sintesi di acidi grassi a catena corta (short chain fatty acids, SCFAs), al fine di ridurre la risposta infiammatoria, ma non esiste ancora un metodo in grado di identificare e quantificare tutti gli SCFAs, incluso l’acido acetico. L’obiettivo di questo lavoro di tesi sperimentale di laurea magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, condotto presso il CEMBIO (Center for Metabolomics and Bioanalysis) dell’Università CEU San Pablo di Madrid nell’ambito del programma Erasmus+, è stato lo sviluppo di un metodo in grado di identificare e quantificare gli SCFAs e, in generale, i composti organici volatili (volatile organic compounds, VOCs) in campioni fecali al fine di identificare possibili biomarkers. Inoltre, un secondo obiettivo è stato quello di costruire un PCDL (Personal Compound Database and Library) con i composti trovati nei campioni fecali, al fine di avere una libreria di massa accurata e specifica per questa matrice. Per analizzare i campioni è stato utilizzato un sistema GC-QTOF-MS, ampiamente utilizzato in metabolomica. In primo luogo, l'ottimizzazione della preparazione dei campioni e della loro derivatizzazione sono state eseguite raccogliendo campioni fecali da persone sane e, una volta ottimizzato il metodo, sono stati utilizzati cinque campioni di controllo per l'analisi successiva. La derivatizzazione è stata eseguita mediante alchilazione e, dopo l'analisi, è stato effettuato un confronto tra questo metodo e uno precedente, utilizzato nel laboratorio CEMBIO, al fine di dimostrare l’adeguatezza della nuova procedura. Dopo l’analisi qualitativa sono state applicate la deconvoluzione con SureMasss, l'allineamento, la revisione dell'integrazione dei picchi e il coefficiente di variazione dei campioni di entrambi i metodi e, in questo modo, è stato possibile vedere la corretta identificazione di SCFAs e VOCs con il nuovo metodo. Questo metodo verrà utilizzato per ulteriori analisi di campioni fecali di neonati e relative madri e nonne, al fine di trovare possibili composti correlati all'allergia al latte, all'interno di un progetto più ampio che verrà eseguito presso il CEMBIO.
|
Abstract
Metabolomics is an investigation approach that is expanding at an increasing speed over the last decade, and it can be applied in different matrices, such as fecal matrix for the analysis of the microbiota. The gut microbiota can be described as a microbial organ placed within a host organ and it is probably at the intersection of all physiological or pathological situations, such as allergy. In this case the microbiota increases the synthesis of short chain fatty acids (SCFAs) in order to decrease the inflammatory response, but there is still not a method capable to identify and quantify all the SCFAs, including acetic acid. The aim of this experimental master thesis work in Medicinal Chemistry and Pharmaceutical Technologies, carried out at the CEMBIO (Center for Metabolomics and Bioanalysis) at the CEU San Pablo University of Madrid within the Erasmus+ program, was the development of a method capable of quantify and identify SCFAs and, in general, organic volatile compounds (VOCs) in fecal samples in order to be able to find other possible biomarkers. Moreover, a second objective was to build a PCDL (Personal Compound Database and Library) with the compounds found in the fecal samples in order to have an accurate mass library specific for this matrix and method. To analyse the samples GC-QTOF-MS system was used, as this is widely used in metabolomics. Firstly, the optimization of the sample preparation and derivatization reaction was performed collecting fecal samples from healthy people, and, once the method was optimized, five control samples were used for the subsequent analysis. Derivatization was carried out with alkylation and, after the analysis, a comparison between this method and a previous one used in CEMBIO laboratory was carried out in order to prove the suitability of the new procedure. After qualitative analysis, SureMass deconvolution, alignment and revision of the integration of the peaks, the coefficient of variation of the samples, of both methods, was made and, in this way, it was possible to see the correct identification of SCFAs and VOCs with the new method. This method will be used for further analysis of fecal samples of infants, their mothers and grandmothers in order to find possible biomarkers correlated to milk allergy within a wider project that will be performed at CEMBIO.
|