Riassunto analitico
Lo studio di seguito presentato è stato finalizzato all’identificazione di un metabolita trovato durante il precedente studio di fingerprinting sui cambiamenti metabolici in pazienti affetti da virus H1N1, presentanti o meno la Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). La gravità e la mortalità associata all’infezione da virus influenzale H1N1 sono dovute principalmente allo sviluppo di complicanze secondarie. La peggiore di queste, in base al tasso di mortalità (fino al 60%), è la ARDS. Purtroppo, la patogenesi e i fattori di rischio per lo sviluppo e progressione dell’ ARDS sono ancora incerti: gli esiti nei pazienti sono imprevedibili e non è disponibile nessun trattamento efficace. Gli studi di metabolomica hanno la finalità di identificare e validare nuovi biomarker associati a specifiche condizioni fisiopatologiche e di trattamento; si basano sull’accoppiamento di varie strategie metodologiche: dal trattamento del campione all’analisi dei dati e l’integrazione dei risultati ottenuti. Tra tutte le fasi, l’identificazione di composti unknown rappresenta sicuramente un punto cruciale: è infatti un processo di importanza fondamentale per l’identificazione di possibili biomarker teragnostici (terapeutici, diagnostici e prognostici) di patologie ancora poco conosciute; inoltre, rappresenta anche la fase più complessa, con molti punti critici dovuti alla mancanza di protocolli e linee-guida, per sviluppare un metodo facile e rapido da applicare “universalmente” (in tutti i laboratori di ricerca) e in caso di limitata disponibilità di standard puri. Infatti, tutt’oggi, il match con standard puri rappresenta l’unica evidenza della reale identità del metabolita. Nell’ambito di un progetto più ampio volto a chiarire i processi patologici associati allo sviluppo dell’ ARDS in pazienti affetti da virus influenzale H1N1, così come a trovare e identificare potenziali biomarker la cui determinazione potrebbe essere regolarmente utilizzata in ambito clinico per ottenere maggiori informazioni sul quadro e sulla gravità della malattia, è stato trovato un composto molto interessante perché classificatore dei due gruppi in esame: pazienti affetti da virus influenzale H1N1 presentanti o meno l’ ARDS. Attraverso studi di spettrometria di massa non è stato possibile chiarire l’identità chimica di questo composto, che è risultato un unknown. Pertanto, il presente studio è stato finalizzato all’ottenimento di una quantità sufficiente di prodotto, di adeguata purezza chimica per procedere ad un’analisi NMR, che potesse fornire informazioni complementari per l’identificazione chimica del metabolita. Con questo scopo, sono state prese in considerazione e combinate diverse tecniche analitiche che permettessero la separazione, purificazione e concentrazione del composto. Sono state testate diverse condizioni di pre-trattamento del campione (precipitazione di proteine e fosfolipidi); sono stati inoltre ottimizzati il processo di estrazione in fase solida in fase inversa (RP-SPE) e le condizioni operative di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Le condizioni finali sono state applicate su un pool di siero ottenuto da 25 campioni di pazienti affetti da H1N1 e da ARDS. In particolare, i campioni sono stati pre-trattati mediante precipitazione delle proteine con soluzione acquosa di zinco solfato ed eliminazione dei fosfolipidi in SPE con una cartuccia contenente zirconio. La RP-SPE è stata effettuata utilizzando la stessa fase stazionaria della cromatografia per purificare e concentrare il composto prima di essere sottoposto a separazione. L’analisi RP-HPLC-QTOF-MS è stata condotta solamente in polarità positiva, in modalità full scan. Il composto puro solido ottenuto in seguito a liofilizzazione è stato poi sottoposto ad analisi NMR; l’identificazione è tuttora in corso.
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