Riassunto analitico
La biocatalisi si occupa di identificare ed applicare specifiche attività enzimatiche come biocatalizzatori per la realizzazione di reazioni sintetiche di interesse applicativo. Una strategia investigativa per la scoperta di nuovi enzimi con prestazioni migliori,è la metagenomica. Questo approccio consiste nell’analisi funzionale e di sequenza dei genomi microbici presenti all’interno di un dato campione ambientale indipendentemente dalla possibilità di conoscere e coltivare in laboratorio i microrganismi. Le epossido idrolasi EH sono gli enzimi responsabili dell’apertura di un epossido mediante l’addizione di acqua con la formazione di un diolo vicinale. Le EH più studiate per applicazioni sintetiche sono quelle appartenenti alla famiglia delle ab-idrolasi (ab-EH) e le Limonene Epossido Idrolasi LEH. La principale applicazione sintetica delle EH è rivolta alla risoluzione cinetica di miscele racemiche di epossidi. Uno dei vantaggi di questi enzimi è che possono agire in due modi diversi sui due enantiomeri epossidici ed ottenere un unico prodotto (enantioconvergenza). Alcuni di essi sono anche attivi nei confronti di meso-epossidi provocandone la desimmetrizzazione e consentendo di ottenere dioli con una resa teorica del 100percento. Questo lavoro di tesi,svolto presso l’Istituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare del CNR di Milano,si inserisce nel Progetto Europeo di Cooperazione Hotzyme il cui obbiettivo è quello di identificare e caratterizzare nuove idrolasi termostabili di interesse industriale,tra cui delle EH. La ricerca è stata effettuata mediante screening in silico all’interno della banca dati ANASTASIA,che raccoglie le sequenze metagenomiche ottenute dai campionamenti di DNA ambientale. Sono state così identificate sei sequenze complete con una buona identità nei confronti di enzimi noti. Le sequenze sono state analizzate, ricercando i residui,catalitici ed ausiliari,e i motivi conservati tipici delle EH,per valutarne l’effettiva appartenenza alla classe enzimatica. È stato quindi possibile stabilire che 4 sequenze codificano per delle ab-EH (Tomsk-EH,CH55-EH,CH65-EH e Sunspring-EH),mentre le altre 2 per delle LEH (Tomsk-LEH e CH55-LEH). Le 6 sequenze sono quindi state isolate dai corrispondenti campioni di DNA metagenomico ed inserite in opportuni vettori di clonaggio. I geni di interesse sono stati successivamente trasferiti nel vettore di espressione pRham C-His ed espressi nel ceppo E.cloni10G. Nella fase di espressione di CH55-EH,CH65-EH e Sunspring-EH si sono incontrati alcuni problemi tipici della produzione di proteine eterologhe. Sono quindi stati selezionati altri due ceppi microbici ingegnerizzati per migliorare l’esito dell’espressione. Gli estratti cellulari sono stati testati con il saggio dell’adrenalina che consente di valutare l’attività di EH in maniera indiretta. Solamente CH55-EH ha mostrato una lieve attività nei confronti di glicidil fenil etere GPE e epicloridrina,ma il monitoraggio tramite GC chirale della reazione con GPE non ha confermato il risultato. Per quanto riguarda le due LEH e Tomsk-EH l’espressione in E.cloni10G ha prodotto alti livelli di proteine per cui si è proceduto con la purificazione proteica mediante IMAC. Le frazioni purificate sono state testate con il saggio dell’adrenalina che ha evidenziato l’attività di entrambe le LEH per SO,VCO e cicloesene ossido CEO,mentre per Tomsk-EH un’attività nei confronti di SO, CEO e cis-2,3-epossibutano. Sono quindi state allestite e monitorate con GC chirale le reazioni tra SO e i 3 enzimi e quella tra Tomsk-EH e CEO. I cromatogrammi hanno mostrato la preferenza delle LEH per l’R-SO,una bassa enantioselettività di Tomsk-EH per l’S-SO e la sua capacità di convertire il meso-epossido CEO a dare un prodotto diolico con eep=90percento.
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