Riassunto analitico
Le istone-deacetilasi (HDACs) sono una famiglia di enzimi che catalizzano la deacetilazione dei residui di lisina principalmente nelle proteine istoniche, ma sono in grado di agire anche su proteine non istoniche coinvolte in diversi pathway biologici. Le HDACs quindi possono agire come modificatori epigenetici nella regolazione dell’espressione genica, ma sono anche coinvolte nella regolazione della trasduzione del segnale, della crescita e della morte cellulare. Ciò rende questi enzimi un buon target farmacologico, soprattutto per lo sviluppo di chemioterapici anticancro. Ad oggi, tra le tante molecole progettate come inibitori di HDAC, solo quattro sono state approvate dall’FDA: Romidepsin, Vorinostat (SAHA), Belinostat e Panobinostat. Sono farmaci utilizzati per il trattamento del T-cell linfoma e del mieloma multiplo. L’esiguo numero di farmaci approvati è dovuto alla mancanza di selettività di queste molecole che comporta una serie di importanti effetti collaterali tra cui anoressia, trombocitopenia e cardiotossicità. Recentemente l’isoforma HDAC6, uno degli enzimi zinco-dipendenti appartenenti alla classe IIb, si è dimostrato un interessante target anticancro perché, essendo in grado di deacetilare anche l’alfa tubulina e la proteina HSP90, la sua inibizione comporterebbe la soppressione delle dinamiche in cui sono coinvolti i microtubuli e porterebbe perciò all’arresto del ciclo cellulare. L’inibizione selettiva di HDAC6, inoltre, sembrerebbe diminuire l’effetto tossico sulle cellule sane, migliorando così il profilo di sicurezza di questi inibitori. Attualmente la progettazione degli inibitori dell’HDAC si è basata su un modello farmacoforico costituito da: Zinc Binding Group (ZBG) che coordina lo zinco nel sito catalitico, un cap group ed un linker che si “accomoda” nel tunnel dell’HDAC, collegando le due porzioni precedenti. La struttura del farmacoforo è costantemente studiata con l’obbiettivo di capire come specifici ZBG, cap group e linker possano influenzare la selettività verso una delle isoforme di HDAC, in particolare verso HDAC6. In questo lavoro abbiamo studiato un nuovo potenziale ZBG, mai riportato in letteratura: il 3-idrossi-5-fenil-isossazolo che in un progetto di tesi precedente era stato ottenuto come sottoprodotto. Essendo stato, comunque, sottoposto ai test biologici, si è dimostrato attivo ma soprattutto selettivo per HDAC6 (alla concentrazione di 10µM si è ottenuto un 50% di inibizione per HDAC6 vs il 6% per HDAC1). Nel mio lavoro di tesi sperimentale ho quindi progettato un efficace metodo di sintesi per ottenere strutture 3-idrossi-5-aril-isossazoliche al fine di produrre una libreria di piccole molecole tale da poter validare il dato ottenuto in precedenza. Inoltre, con questa libreria si potranno valutare le relative correlazioni struttura-attività in modo tale da “regolare” la sintesi futura di questo tipo di inibitori. Il design di queste molecole prevede, in aggiunta, diversi gruppi linker utili ad esplorare come diverse componenti strutturali, al di fuori dello ZBG, possano influenzare la selettività e l’attività verso HDAC6. In particolare, tra i linker scelti, vi sono gruppi aromatici variamente sostituiti che possono di per sé fungere anche da piccoli cap group oppure vi sono eterocicli che, come studiato da Senger et al. (J. Med. Chem. 2016, 59(4), 1545-1555), sembrano essere in grado di modulare la selettività e la potenza verso HDAC6. Le quindici molecole progettate sono state perciò da me sintetizzate e sono attualmente in corso i test di affinità per gli enzimi HDAC6 ed HDAC1, sia utilizzando enzimi purificati che derivati da lisati cellulari. Infine, sono state fatte titolazioni, sfruttando la tecnica analitica NMR, per dimostrare la capacità di queste molecole di coordinare lo zinco.
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Abstract
Histone deacetylases (HDACs) are a family of enzymes that catalyze the deacetylation of lysine residues mainly from histone proteins, but they also act on non-histone proteins, which are involved in various biological pathways. Therefore, HDACs act as epigenetic modifiers on the regulation of gene expression, but they are also involved in the regulation of signal transduction, growth and cell death. This fact makes these enzymes a good pharmacological target, especially for the development of anticancer drugs. Until now, among many molecules designed as HDAC inhibitors, only four of them have been approved by the FDA: Romidepsin, Vorinostat (SAHA), Belinostat and Panobinostat. They are used for the treatment of T-cell lymphoma and multiple myeloma. The small amount of approved drugs in this class is surely related to the lack of selectivity of these molecules, which entails a series of important side effects including anorexia, thrombocytopenia and cardiotoxicity. Recently HDAC6, one of the zinc-dependent enzyme belonging to class IIb, has shown to be able to deacetylate also alpha tubulin and HSP90, so its inhibition would produce the suppression of microtubule dynamics and lead to cell cycle arrest and apoptosis. The selective inhibition of HDAC6 isoform seems also to cause fewer toxic effects on healthy cells, potentially improving the safety profile of this class of molecules. Currently the design of HDAC inhibitors is based on a pharmacophore model presenting one Zinc Binding Group (ZBG) which coordinates the Zn2+ in the catalytic site, a cap group and a linker group that accommodates in the HDAC tunnel and connects the two portions previously defined. The structure of the pharmacophore is continuously under evaluation with the aim to understand how specific ZBG, cap group and linker can influence the HDAC isoforms selectivity. In practice, I studied a new potential ZBG, not yet reported in literature: the 3-hydroxy-5-phenyl-isoxazazole scaffold. This compound was obtained as by-product in a previous experimental thesis work. The biological tests proved its activity and selectivity against HDAC6 (50% inhibition on HDAC6 vs 6% on HDAC1, at 10µM concentration). Therefore, in my thesis work I studied a good method to synthesize the 3-hydroxy-5-aryl-isoxazole-based compounds to obtain a library of small molecules suitable to validate the previous data. In other words, this thesis project wants to verify if the 3-hydroxy-isoxazole scaffold can coordinate the zinc atom and start to outline some SAR in order to gain more information for the future synthesis of this class of inhibitors. In addition, the design of these molecules considered also some groups as linkers, in order to explore how different moieties, other than the ZBG, can influence the HDAC activity and selectivity. In particular, aromatic groups, variously substituted, were inserted and some of them could act as small cap groups. Secondly, heterocyclic groups were inserted because they seem capable to modulate the power and the selectivity against the HDAC6 isoform, as suggested by Senger et al. (J. Med. Chem. 2016, 59(4), 1545-1555). In summary, I have synthesized fifteen molecules and currently they are tested in binding assays on HDAC6 and HDAC1 enzymes, both purified and derived from cell lysates. I did also NMR titrations to demonstrate the ability of these molecules to coordinate the zinc atom, but, even though it was demonstrated, these data need further insights. In conclusion, all the results obtained will allow us to verify whether this innovative ZBG is truly capable to modulate activity and selectivity towards HDACs. Consequently this class of molecules will be improved choosing “ad hoc” linkers and cap groups to obtain highly selective HDAC6 inhibitors.
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