• Evolution-strategy
• Genome-wide-study
• Glutathione
• S.cerevisiae
• Wine-strain

Il glutatione (L-γ-glutamil-L-cisteinilglicina) è un tripeptide ubiquitario caratterizzato dal gruppo funzionale tiolico. Grazie alle sue peculiari proprietà redox e nucleofiliche, il glutatione (GSH) gioca un ruolo centrale in molti processi biologici. L’interesse crescente per il GSH nei processi di vinificazione, è legato al suo importante contributo nella stabilizzazione e protezione di mosti e vini, dove limita l’imbrunimento attraverso la riduzione degli o-chinoni, evita la formazione dei caratteri di invecchiamento atipico ed esercita un effetto protettivo verso differenti composti aromatici. Tuttavia, il contenuto di GSH in mosti e vini, così come la sua concentrazione durante la fermentazione alcolica, è estremamente variabile e dipende da molteplici fattori. Tra questi, Saccharomyces cerevisiae gioca un ruolo chiave, in quanto può utilizzare o secernere GSH durante la fermentazione alterandone il contenuto finale in vino.
Gli obiettivi di questa ricerca sono stati la selezione di nuovi ceppi enologici di lievito capaci di incrementare il quantitativo finale di GSH nel vino e l’individuazione delle variazioni genetiche alla base del fenotipo migliorato nei ceppi evoluti. Per generare nuovi ceppi di S. cerevisiae con un’alta produzione di GSH, abbiamo sviluppato una strategia basata sull’evoluzione adattativa, che combina la ricombinazione sessuale delle spore con l’applicazione del molibdato Mo(VI) come pressione selettiva. Il Mo(VI), analogo tossico del solfato, è stato efficace per la selezione di ceppi con il fenotipo alta produzione di GSH, probabilmente attivando il meccanismo base di resistenza ai metalli pesanti, che nei lieviti coinvolge il GSH.
La nostra strategia è stata applicata al ceppo di S. cerevisiae UMCC 855, un ceppo enologico appartenente alla Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), e i ceppi selezionati, resistenti al Mo(VI), sono stati valutati per la produzione di GSH in mosto sintetico ed in test di microvinificazione effettuati con mosto d’uva. Grazie a questa strategia, non OGM, abbiamo ottenuto 2 ceppi, UMCC 2581 e UMCC 2585, capaci di incrementare il contenuto di GSH nel vino, rispettivamente del 100% e del 36% rispetto al ceppo parentale UMCC 855: in particolare, il ceppo UMCC 2581 ha mostrato una elevata produzione di GSH in quasi tutti i mezzi testati.
Con lo scopo di studiare le modifiche alla base del fenotipo alta produzione di GSH, sono stati determinati il genoma e il trascrittoma del ceppo parentale e dei ceppi evoluti selezionati. Per identificare i geni e le vie metaboliche responsabili della resistenza al Mo(VI), abbiamo mappato i loci dei tratti quantitativi (QTL), con un processo in tre passaggi che ci ha permesso di individuare due loci principali, sui cromosomi quattro e dodici. Per un più completo studio delle variazioni genetiche, sono state incluse anche analisi dei polimorfismi a singolo nucleotide, di inserzioni e delezioni e delle variazioni nel numero di cromosomi. Infine, sono stati effettuati esperimenti di RNA-seq, con l’obiettivo di valutare la variazione dell’espressione genica tra il ceppo parentale e i ceppi evoluti.
La strategia evolutiva utilizzata in questo studio si è mostrata particolarmente efficace, permettendo un considerevole risparmio di tempo rispetto ai comuni approcci evolutivi. Difatti, la nostra strategia non richiede multipli turni di selezione e lunghi periodi di coltura, poichè i ceppi evoluti sono rapidamente riconosciuti attraverso il fenotipo di resistenza al Mo(VI). Inoltre, le informazioni genetiche fornite con questo lavoro potrebbero essere utilizzate per un’ulteriore ottimizzazione dei ceppi evoluti, o per un ancor più rapida identificazione di nuovi ceppi alto produttori di GSH, attraverso una strategia di selezione ‘marker-assisted’.

Glutathione (L-γ-Glutamyl-L-Cysteinylglycine) is a thiol-containing tripeptide universally distributed in living cells. Due to unique redox and nucleophilic properties, glutathione (GSH) plays central roles in almost all the major biologic processes. For its important contribution in stability and protection of musts and wines, GSH has been the subject of an ever-growing interest in winemaking. In fact, in oenological matrices GSH reduces the o-quinones limiting the formation of brown pigments, avoids the formation of atypical aging characters and exerts a protective effect on several aromatic compounds. Nevertheless, GSH content in must and wine as well as the evolution of GSH concentration during alcoholic fermentation is highly variable and depend on multiple factors. Among these, Saccharomyces cerevisiae plays a key role since it can utilize or secrete GSH during fermentation altering the final GSH content in wine. The goals of this research were to select new wine yeast strains able to increase the final amount of GSH in wine and to identify the genetic changes underlying the improved phenotype of the evolved strains at a genome-wide scale. To generate new S. cerevisiae strains with enhanced GSH production, we designed an evolution-based strategy that combines the sexual recombination of spores with the application of molybdate Mo(VI) as selective pressure. Specifically, Mo(VI), which is a toxic analogue of sulfate, was effectively used to generate the strains with the desired high-GSH phenotype, probably activating the yeast common metal response that involves GSH. Our strategy was applied to S. cerevisiae UMCC 855, a wine strain from the UNIMORE Microbial Culture Collection (UMCC), and the selected molybdate-resistant strains were further screened for GSH production in synthetic must and in microvinification assay performed with grape juice. By this non-genetically modified strategy, we obtained two evolved strains, UMCC 2581 and UMCC 2585, able to enhance the GSH content in wine with an increase of 100% and 36%, respectively, compared to the parental strain UMCC 855 and, in particular, the UMCC 2581 strain was successful in increasing the GSH content in almost all the tested media. Exploiting the potential of next-generation sequence technologies, the genome and transcriptome of parental and selected evolved-strains were determined in order to investigate the changes underlying the high GSH phenotype. We used a three-step process for quantitative trait loci (QTL) mapping to identify genes and pathways responsible for Mo(VI) resistance trait and we found two main loci on chromosome four and twelve responsible for resistance to Mo(VI). For a comprehensive study of the genetic variation, single nucleotide polymorphisms, insertions and deletions analysis and chromosomal copy number variations were also included. Finally, in order to capture gene expression changes between the parental and selected strains, RNA-seq experiments were performed. The evolution-based strategy used in this study has proved to be particularly effective and time-saving compared to the common evolutionary approaches. In fact our strategy does not require multiple rounds of screening and extensive cultivation periods as the evolved strains are rapidly recognized through the selectable molybdate resistance phenotype. Moreover, the genetic information provided in this study could be useful for a further optimization of the evolved strains and for providing an even more rapid approach to identify new strains, with a high GSH production, through a marked-assisted selection strategy.