Riassunto analitico
Le neoplasie mieloproliferative BCR-ABL negative (MPNs), sono disordini clonali della cellula staminale caratterizzati da un’aumentata proliferazione delle cellule mieloidi terminalmente differenziate. Le basi molecolari delle MPNs sono state identificate pochi anni fa con l’identificazione di due mutazioni somatiche nei geni JAK2 e MPL. Recentemente, sono state riportate mutazioni nel gene della calreticulina (CALR) nel 60-80% dei pazienti non mutati per JAK2 e MPL. CALR è un chaperone che lega il calcio localizzato nel lume del reticolo endoplasmatico e le sue mutazioni risultano nella perdita di buona parte del dominio c-terminale e del segnale KDEL, che potrebbe causare mis-localizzazione e aberrante funzionalità della proteina. Per esplorare il ruolo delle mutazioni di CALR nel differenziamento di cellule progenitrici/staminali emopoietiche (HPSCs), abbiamo studiato gli effetti dell’overespressione di CALR mutato in cellule CD34+ cordonali. Il monitoraggio ha mostrato che l’espressione forzata di CALR WT e mutato è in grado di indurre il commitment emopoietico attraverso i lineage megacariocitario (MK) ed eritroide. Al contrario, il silenziamento di CALR induce repressione del differenziamento MK ed eritroide. Per caratterizzare gli effetti delle mutazioni di CALR a livello molecolare, abbiamo analizzato i profili di espressione di cellule CD34+ cordonali overesprimenti CALR WT e mutato. L’analisi ha identificato una lista di geni differenzialmente espressi. Tra i geni up-regolati, abbiamo evidenziato geni coinvolti nell’aggregazione piastrinica, infiammazione e differenziamento eritroide, potenzialmente correlati alle caratteristiche della malattia. L’elevata espressione di CALR endogeno, non ci ha permesso di valutare completamente gli effetti indotti dalla proteina mutata. Perciò abbiamo effettuato il knock-out di CALR endogeno in K562, una linea cellulare eritromieloblastoide, con l’utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9 e di conseguenza abbiamo overespresso CALR WT e mutato. CALR è stato descritto come coinvolto nella morte cellulare immuno mediata (ICD) e la sua esposizione sulla memebrana plasmatica di cellule morenti ne favorisce il riconoscimento e l’eliminazione da parte di fagociti professionisti. Dopo aver trattato le K562 con induttori di ICD, abbiamo notato la diminuizione di CALR mutato a livello della membrana plasmatica, suggerendo un ruolo di CALR mutato nell’eludere il sistema immunitario, che solitamente caratterizza le cellule tumorali. Infine per ottenere maggiori evidenze che le mutazioni di CALR sono associate allo sviluppo di disordini mieloproliferativi, abbiamo adottato un modello murino. A questo fine, cellule midollari lineage negative (Lin-) ottenute da topi Ly5.1, sono state trasdotte ex vivo con un vettore retrovirale codificante per CALR WT e mutato e successivamente sono state trapiantate in topi singenici letalmente irradiati attraverso la vena della coda. Ad oggi, sono stati trapiantati 28 topi, 3 topi per costrutto sono stabilmente ricostituiti con le cellule del donatore, mostrando un livello di enfgraftment attorno al 75% nel sangue periferico. I topi saranno sacrificati 9-12 mesi dopo il trapianto per verificare se e con quale estensione le mutazioni di CALR sono responsabili dello sviluppo della malattia. In conclusione, questi dati suggeriscono un ruolo di CALR nella regolazione dello sviluppo eritroide e MK, i due lineage più colpiti nelle MPNs. Inoltre, i dati di espressione sulle K562 CALR -/- hanno mostrato che CALR è coinvolto nella regolazione dell’espressione genica di diversi geni responsabili dello sviluppo leucemico e suggeriscono un potenziale ruolo di CALR mutato nell’eludere il sistema immunitario. Nel complesso, i nostri dati supportano fortemente un ruolo di CALR nello sviluppo di una sindrome mieloproliferativa.
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Abstract
The BCR-ABL-negative myeloproliferative neoplasms (MPNs), are clonal stem cell disorders characterized by increased proliferation of terminally differentiated myeloid cells. The molecular basis of MPNs has been recognized few years ago with the identification of somatic gain-of-function of JAK2 and MPL mutations. Recently, mutations in the calreticulin gene (CALR) have been reported in 60-80% of JAK2 and MPL unmutated ET and PMF patients. CALR is Ca2+-binding chaperone found in the lumen of endoplasmic reticulum (ER) and its mutations result in a loss of most of the acidic C-terminal domain and the KDEL signal, which might lead to protein mis-localization and aberrant protein function and stability.
In order to explore the role of mutated CALR in the proliferation and differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells (HPSCs), we studied the effects of mutated CALR overexpression in Cord Blood (CB) CD34+ cells. Assessment of cell differentiation unveiled that mutated and WT CALR enforced expression is able to skew the haematopoietic commitment towards the MK and erythroid cell lineages. Conversely, CALR silencing induced a marked repression of MK and erythroid differentiation. In order to characterize the effects of CALR mutations on human hematopoietic cells at the molecular level, we analyzed the coding RNA profiles of CB CD34+ overexpressing mutated and WT CALR. This analysis identified a list of differentially expressed genes. Among upregulated genes, we found genes involved in platelet aggregation, inflammation and erythroid differentiation, potentially related to the characteristics of the disease. Due to the high expression level of endogenous CALR we were not able to fully evaluate the effects induced by the mutated protein. To overcome this issue we knocked-out endogenous CALR in K562, a human erythromyeloblastoid leukemia cell line, by means of CRISPR/Cas9 Technology and subsequently overexpressed mutated and WT CALR. CALR has been extensively described to be involved in Immunogenic Cell Death (ICD) and its exposure in the plasma membrane of dying cells elicits their recognition and removal by professional phagocytes. After treating K562 cells with ICD inducers, we noticed a decrease in the exposure of mutated CALR on the plasma membrane, suggesting that mutated CALR could play a role in the excape from the immune system that usually characterizes tumor cells.
Finally to obtain further evidence that CALR mutations are associated with the development of a myeloproliferative disorder, we took advantage of a murine Bone Marrow Transplant (BMT) model. To this end, BM Lineage Negative Cells (Lin-) collected from Ly5.1 mice have been transduced ex vivo with retroviral vectors coding for WT and mutated CALR and then transplanted via tail vein injection into irradiated syngeneic mice. Currently, 28 mice have been transplanted, 3 mice/construct are stably reconstituted with donor cells, showing engraftment level around 75% in the peripheral blood. Mice will be sacrificed between 9 to 12 months after transplant to assess whether and to what extent CALR mutations are responsible for the development of the disease.
Altogether our results suggest a role for CALR in the regulation of MK and erythroid development, the two lineages that are mostly affected in MPNs. Moreover, our data on CALR -/- K562 showed that CALR is involved in the gene expression regulation of several genes responsible for leukemic development and suggested a potential role for mutated CALR in the escape from the immune system. On the whole, our data strongly support a role for mutated CALR in the development of a myeloproliferative disease.
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