Riassunto analitico
Il patosistema Brachypodium-Puccinia brachypodii è un utile modello per la genomica traslazionale delle interazioni tra le ruggini e i loro cereali ospiti.
Tre tratti quantitativi (QTL) Rpbq1, Rpbq2 e Rpbq3, per la resistenza all'isolato H-ki del patogeno della ruggine fogliare Puccinia brachypodii, sono stati precedentemente mappati in Brachypodium sui cromosomi 2, 3 e 4, in una popolazione segregante ottenuta dall'incrocio tra le linee inbred Bd3-1 e Bd1-1. Per la validazione dei tre QTL, famiglie da F3 a F7, derivate dall'autofecondazione di una singola pianta F2 e portatrici di un singolo QTL allo stato di omozigosi, sono state selezionate attraverso una genotipizzazione con marcatori fiancheggianti, e fenotipizzate con l'isolato H-Ki. Rpbq2 e Rpbq3 sono stati confermati ed è stata data loro la priorità per ulteriori ricerche.
L'obiettivo principale di questo studio è il mappaggio fine delle due regioni genomiche associate alla resistenza alla ruggine in modo da determinare i geni candidati e procedere con il clonaggio dei due QTL.
Per raggiungere tale obiettivo, due grandi popolazioni segreganti composte da 497 individui per Rpbq3 e 434 per Rpbq2 sono state sviluppate. Le sequenze delle due regioni dei QTL delle due linee parentali sono state poi allineate per la ricerca di geni contenenti polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e/o inserzioni-delezioni (InDel). Marcatori SNP e sequence tagged site (STS) sono stati disegnati con il fine di trovare individui ricombinanti.
Grazie a questi marcatori, 11 individui ricombinanti per Rpbq2 e 12 per Rpbq3 sono stati trovati e moltiplicati per autofecondazione per stabilizzare la ricombinazione allo stato di omozigosi; successivamente una seconda genotipizzazione è stata necessaria per selezionare gli individui omozigoti ricombinanti. Per raffinare la posizione dei due QTL, i ricombinanti sono stati fenotipizzati con l'isolato H-Ki del patogeno Puccinia brachypodii. La loro progenie è stata fenotipizzata l'anno successivo per la validazione dell'esperimento.
Grazie all'identificazione dei ricombinanti e allo screening fenotipico, l'intervallo di Rpbq3 è stato ridotto e il segmento compreso tra Bradi4g10017 e Bradi4g10230 è stato identificato come quello più associato alla resistenza. L'intervallo di Rpbq2 è stato ridotto anch'esso al segmento compreso tra Bradi3g16020 e Bradi3g16140.
Successivamente un'analisi dei domini funzionali delle proteine usando NCBI Conserved Domain Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) e InterPro: protein sequence analysis & classification (http://www.ebi.ac.uk/interpro) è stata fatta per tutti i geni presenti nei due intervalli raffinati dei due QTL.
Comparando i risultati ottenuti dall'analisi bioinformatica e dal mappaggio fine è stata ottenuta una prima lista dei geni candidati più promettenti per la resistenza alla ruggine in B. distachyon, la quale comprende 6 geni per Rpbq2 e 3 geni per Rpbq3.
Questi geni candidati potrebbero portare alla clonazione dei due QTL.
Inoltre una valutazione sulla isolato-specificità dei geni di resistenza è stata eseguita attraverso l'inoculo delle pseudo-RIL sviluppate in precedenza con 4 differenti isolati di Puccinia brachypodii: NL-De, NL-Vij, F-Fl e F-Co. Come approccio complementare un pannello di 54 differenti accessioni di Brachypodium distachyon raccolte intorno al mondo, e risequenziate dal JGI (USA), è stato screenato per la risposta alla Puccinia brachypodii.
Questo studio rappresenta il primo mappaggio fine per il clonaggio QTL dei geni responsabili della resistenza alla ruggine fogliare causata dal patogeno Puccinia brachypodii nella specie modello Brachypodium distachyon, per la genomica translazionale verso i cereali di maggiore rilevanza economica.
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Abstract
The Brachypodium-Puccinia brachypodii pathosystem is a useful model for translational genomics of rust interactions with their cereal hosts.
Three quantitative trait loci (QTL) Rpbq1, Rpbq2 and Rpbq3, for resistance to the H-Ki isolate of the leaf rust pathogen, were previously mapped on Brachypodium chromosomes 2,3 and 4, in a segregating population derived from the cross between the inbred lines Bd3-1 and Bd1-1. For validation of the three QTLs, F3 to F7 families derived from single F2 plants, and harbouring single QTLs at homozygosous state, were selected by genotyping of flanking markers, and phenotyped with the H-Ki isolate. Rpbq2 and Rpbq3 were confirmed and prioritized for further research.
The main aim of this study is to fine map the two genomic regions associated to the leaf rust resistance in order to obtain a precise targeting of candidate genes towards the cloning of the two QTLs.
To reach this aim, two large segregating populations composed of 497 individuals for Rpbq3 and 434 for Rpbq2 were developed. Sequences of the QTL regions of the two parental lines were then aligned and searched for the discovery of gene-based single nucleotide polymorphisms (SNP) and Insertion-deletions (InDel). SNPs and sequence tagged sites (STSs) markers have been designed in order to find recombinant individuals.
Thanks to these markers, eleven recombinant individuals for Rpbq2 and 12 for Rpbq3 were found and multiplied by selfing to stabilize the recombinations at homozygosity; a second round of genotyping was thus necessary to select homozygous recombinant individuals. To refine the position of the two QTLs, the recombinants were phenotyped with the H-Ki isolate of Puccinia brachypodii. Their progenies were phenotyped one year later as to validate the experiment.
Thanks to the recombinant identification and screening the Rpbq3 interval was reduced, and the chromosome segment comprised between Bradi4g10017 and Bradi4g10230 was identified as the most linked with the resistance. The Rpbq2 interval was reduced as well, to the segment comprised between bradi3g16020 and bradi3g16140.
Subsequently a functional protein domain analysis using NCBI Conserved Domain Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) and InterPro: protein sequence analysis & classification (http://www.ebi.ac.uk/interpro) was performed for all genes residing at the two refined intervals for the two QTLs.
Comparing the results obtained from the bioinformatics analysis and the fine mapping study , a first list of most promising candidate genes for the false brome rust resistance in B. distachyon composed of 6 genes for Rpbq2 3 for Rpbq3 was obtained.
These candidate genes might lead to the cloning of the two QTLs.
Moreover an evaluation of isolate-specificity of the resistance genes was performed via inoculations of the developed pseudo-RILs with other 4 different isolates of Puccinia brachypodii: NL-De, NL-Vij, F-Fl and F-Co. As a complementary approach a diversity panel of 54 different accessions of Brachypodium distachyon collected around the world, resequenced by JGI (USA), was screened for response to Puccinia brachypodii.
This study represents the first fine mapping for the QTL cloning of the resistance genes to leaf rust pathogen Puccinia brachypodii in the model plant Brachypodium distachyon, for translational genomics to the economically relevant cereals.
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