Riassunto analitico
Il Mieloma Multiplo (MM) è una neoplasia caratterizzata dalla proliferazione e l’accumulo di linfociti B e di plasmacellule (PC), e dalla aumentata produzione di immunoglobuline (Ig) monoclonali. La PC mielomatosa è caratterizzata da un elevatissimo grado di alterazioni genomiche.
Il ruolo del gene oncosoppressore TP53 è cruciale nel MM, ma la maggior parte dei dati a disposizione in letteratura provengono da sequenziamento tradizionale. Questo studio si propone di indagare il gene tramite tecniche di sequenziamento profondo (NGS) in pazienti con MM che hanno ricevuto Bortezomib (Velcade®) nell’ambito di una terapia associata a trapianto autologo di cellule staminali (ASCT), per poter analizzare la frequenza di eventi mutazionali e per poterne studiare l’effetto sulla funzionalità del gene e quindi sull’andamento clinico della patologia.
La scelta dei pazienti è stata guidata dalla relazione tra la funzione della proteina p53 e la terapia con Bortezomib, un inibitore del proteasoma che è capace di salvaguardare p53 e di favorire i suoi meccanismi di riparazione del DNA e apoptosi in caso di danno irreversibile. L’azione del farmaco sulle cellule di MM è mediata anche dalla capacità di p53 di indurre apoptosi in caso di danno esteso al DNA. In quest’ottica, la terapia ha bisogno di una proteina p53 funzionante che possa contribuire ad una maggiore efficacia dell’azione di Bortezomib. Perciò è importante indagare approfonditamente il rapporto tra le diverse alterazioni del gene nei pazienti trattati con Velcade® e il loro andamento della malattia, nella prospettiva di una stratificazione dei pazienti in base a TP53 per la scelta della migliore terapia.
Le tecniche di NGS rappresentano un metodo d’avanguardia molto specifico di analisi di varianti a frequenze molto basse, anche molto più basse rispetto alla soglia del 5% tipica del metodo Sanger. Inoltre è da considerare anche la scarsità di informazioni sulla sequenza di TP53 nel MM. Queste osservazioni spiegano il motivo della scelta della tecnologia di NGS che costituisce il centro di questo studio.
Dei pazienti idonei per lo studio si è estratto il DNA dalla frazione CD138+ separata da prelievi di MO. Questo materiale è stato utilizzato per l’esecuzione dell’esperimento di sequenziamento di 8 esoni del gene TP53 tramite tecnologia 454 Roche GS Junior.
Tramite un esperimento in cui sono sequenziate delle diluizioni seriali di una mutazione nota del gene è stata definita una soglia di attendibilità da utilizzare come cut-off dei valori di frequenza delle varianti trovate nei campioni, supportata da analisi statistiche effettuate in collaborazione con il Dipartimento di Bioinformatica dell’Università del Piemonte Orientale.
Dei risultati, sono stati considerati sono i campioni relativi alla fase di esordio (101 pazienti). Varianti di TP53 sono state trovate anche in pazienti portatori della delezione del cromosoma 17p, a differenza di quanto riportato in letteratura. Dei 101 pazienti, 6 non presentano nessuna variante nel gene. In tutto, sono state individuate 867 varianti (mediana di 8 per paziente); 32 risultano SNP validati, ma 821 risultano come “deleterious” (classificazione SIFT). Le varianti sono state suddivise in clonali e subclonali in base alla loro frequenza (superiore o inferiore al 90%). È stato valutato l’effetto sulle curve di Progression Free Survival e Overall Survival dei pazienti con e pazienti senza varianti interpretate come mutazioni deleterie.
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