Riassunto analitico
La micropropagazione e la crioconservazione sono due importanti tecniche di derivazione biotecnologica utilizzate a supporto delle strategie di conservazione ex-situ, mirate alla salvaguardia di specie vegetali spontanee e di interesse agroalimentare. Questa tesi raccoglie i risultati frutto di esperimenti di propagazione in vitro e crioconservazione condotti su una specie di quercia, Quercus robur, e cultivar emiliane di Vitis vinifera. Relativamente a Q. robur, sono state indagate tutte le fasi della micropropagazione allo scopo di ottimizzare un protocollo applicabile alla propagazione e conservazione di genotipi provenienti da popolazioni d’interesse e di esemplari monumentali. Partendo dalla fase di inizio e stabilizzazione della coltura, sono state valutate sia l’influenza della sorgente di espianto che della posizione delle gemme sulla pianta madre sullo sviluppo in coltura di gemme apicali e ascellari. La fase di moltiplicazione è stata messa a punto presso il Laboratory of Forestry Biotecnology dell’IIAG (Santiago de Compostela, Spagna): sono state confrontate quattro concentrazioni ormonali, al fine di determinare quella più idonea alla crescita degli espianti durante le subcolture. I risultati migliori sono stati osservati sul terreno contenente 0,2 mg/l di benziladenina. Questa concentrazione è stata mantenuta anche in esperimenti successivi, condotti presso il CNR IVALSA di Sesto Fiorentino, nei quali è stata confrontata la crescita su substrato solido con quella in coltura liquida, in bioreattori Plantform ad immersione temporanea (TIS). La tecnologia TIS si è rivelata più performante nel processo di moltiplicazione, con un aumento del tasso di crescita relativa registrato al termine delle subcolture. Test di radicazione hanno permesso di completare lo studio del protocollo, evidenziando l’effetto positivo del carbone attivo nel prevenire l’imbrunimento dei fusti. La valutazione di parametri micro morfologici delle foglie, densità stomatica e dimensioni degli stomi, ha fornito utili indicazioni in merito all’acclimatazione. Su substrato agarizzato è stato possibile mantenere piante radicate in vitro per quasi un anno, senza la necessità di rinnovamento della coltura. Per quanto concerne il mantenimento degli espianti a temperature ultra basse, sono stati ottenuti risultati positivi applicando protocolli di crioconservazione a plumules isolate da embrioni zigotici di quercia. Le metodiche di disidratazione testate presso il Laboratory of Seed Biology, a Kornik (Polonia), vitrificazione con PVS3 ed esposizione a gel di silice, si sono rivelate entrambe efficaci nel garantire la sopravvivenza degli espianti dopo congelamento in azoto liquido. Le percentuali di sopravvivenza registrate dopo lo scongelamento erano di circa il 15% nel caso della vitrificazione e del 25% nel caso della disidratazione con gel di silice. Ulteriori prove di micropropagazione sono state condotte prendendo in esame sei cultivar di vite: Lambrusco salamino, L. di Sorbara e L. Marani, Trebbiano modenese, Ancellotta e Malbo gentile. Sono stati testati due substrati e due diverse concentrazioni ormonali per valutare rispettivamente le percentuali di espianti produttivi e la lunghezza media dei fusti in cultura. Per la radicazione sono state testate invece tre condizioni colturali, differenti per concentrazione ormonale e presenza/assenza di carbone attivo. La stabilità genetica del materiale micropropagato è stata valutata mediante l’analisi di marcatori molecolari microsatelliti. Lo studio di queste sequenze, particolarmente importante per le specie agroalimentari, è un primo indicatore di eventuali mutazioni somaclonali che potrebbero emergere durante il processo di propagazione in vitro, soprattutto a seguito di numerose subcolture. Le indagini condotte su espianti alla terza subcoltura non hanno evidenziato differenze significative fra il profilo delle piante propagate e quello della piante madre.
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Abstract
Micropropagation and cryopreservation are two important techniques of biotechnological derivation, commonly employed in the ex situ conservation strategies of rare and threatened wild species and cultivated species of agricultural interest. This thesis presents the results of in vitro propagation and cryopreservation experiments conducted on one oak species, Quercus robur, and six Italian cultivars of Vitis vinifera, cultivated typically in Emilia Romagna Region. Concerning Q. robur, all the micropropagation phases have been studied with the aim to obtain an effective protocol useful for the propagation and conservation of genotypes from wild populations and monumental trees. For culture initiation and stabilization, the influence of explants sources and the previously position of explants on mother plants were studied in relation with apical and axillary buds development in in vitro cultures. In the multiplication phase, carried out in collaboration with the IIAG Laboratory of Forestry Biotecnology (Santiago de Compostela, Spain), four hormone concentrations were tested to establish the optimal condition for shoot proliferation during the subcultures. Best results were obtained on medium added with 0.2 mg/l of benziladenine. This concentration was used also in subsequent researches, conduced at the IVALSA Laboratory (CNR, Sesto Fiorentino). In these experiments the explants growth on gelled substrate was compared with a new system of temporary immersion (TIS), Plantform bioreactor. The results demonstrated that Plantform system was able to induce an increase of the relative growth rate during the subcultures.
Rooting tests showed that all tested media promoted roots formation and that activated carbon exerts a positive effect to prevent shoots browning. The evaluation of micro morphological parameters of leaves, stomata density and stomata size, gave important information about acclimatization phase. On gelled medium, the rooted plantlets could be maintained about one year, without culture medium renewal. Regarding the explants maintenance at ultra-low temperatures, positive results were obtained when cryopreservation was attempted. A protocol for the storage of plumules, isolated from zygotic embryos of oak, was defined in collaboration with the Laboratory of Seed Biology of Kornik (Poland). Both vitrification with PVS3 and dehydration with silica gel were tested, and the results demonstrated that both the techniques were able to guarantee the survival of the plumules after the storage in liquid nitrogen. The percentages of survived explants were about 15% for plumules pre-treated with PVS3 and 25% for those ones dehydrated with silica gel. Further micropropagation tests were carried out studying six grapevine cultivars: Lambrusco salamino, L. di Sorbara e L. Marani, Trebbiano modenese, Ancellotta and Malbo gentile. Two different culture media and two hormone concentrations were tested with the aim to asses percentages of productive explants and length of shoot in culture, respectively. For the rooting phase, three culture conditions were studied, with different hormone concentrations and presence/absence of activated carbon. The genetic stability of propagated material was valued by the analysis of molecular markers microsatellite. The study of these sequences is very important especially for the cultivated species because it is the first sign of somaclonal variations, which can occur during the micropropagation process, especially after numerous subcultures. Analysis conducted on shoots obtained after three subcultures did not lightened significant differences between the profile of propagated plants and those ones of the mother plants.
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