Riassunto analitico
Lo studio della variabilità genetica mediante l’utilizzo di approcci citogenetici e molecolari nell’afide Myzus persicae costituisce l’oggetto della presente tesi di dottorato. Myzus persicae è considerato uno dei più dannosi fitofagi per i gravi danni che puo’ provocare a colture di notevole importanza agro-alimentare soprattutto a causa della sua capacità di trasmettere virus fitopatogeni. La natura olocentrica dei suoi cromosomi rendono questo afide molto interessante da un punto di vista citogenetico. L’assenza di un centromero localizzato ma un’attività centromerica diffusa lungo tutto l’asse cromosomico, consentono la diffusione di frammentazioni cromosomiche, alcune delle quali gia’ associate alla resistenza ad agrofarmaci. Combinando esperimenti di ibridazione in situ fluorescente e misurazioni micrometriche della lunghezza cromosomica, ho potuto rivelare la presenza di riarrangiamenti intra e inter-individuali degli autosomi 1 e 3 e, contrariamente a quanto riportato in letteratura, anche dei cromosomi sessuali. Tali frammentazioni ricorrenti nelle stesse regioni cromosomiche hanno fatto ipotizzare la presenza di siti fragili. Pertanto, la natura olocentrica dei cromosomi associata ad un sistema funzionale telomero telomerasi attivo a livello di tutti i tessuti e la partenogenesi apomittica, sono i presupposti strutturali/funzionali in grado di permettere la stabilizzazione delle frammentazioni cromosomiche in questo modello.La continua generazione de-novo dei telomeri potrebbe suggerire il motivo per cui le popolazioni M. persicae presentano più frequentemente un aumento piuttosto che una riduzione del numero cromosomico. La scelta di generare una sonda cromosomica per il cromosoma X combinata con esperimenti di FISH, e’ nata al fine di poter migliorare l’analisi della struttura del cariotipo. Purtroppo i risultati ottenuti sono risultati ancora interlocutori, poiche’ i segnali di ibridazioni ottenuti sinora sono concentrati sulle regioni eterocromatiche dell’X e sulle regioni telomeriche di tutto il complemento. La variabilità genetica delle popolazioni in M. persicae e’ stata studiata anche, attraverso l’impiego di otto microsatelliti. Ho analizzato 12 popolazioni provenienti da campo e 55 ceppi clonali in allevamento da molti anni. Per le popolazioni da campo i loci analizzati sono risultati avere una discreta variabilita’ presentando, infatti, 6-25 alleli per locus e 2-12 alleli per popolazione. Tre popolazioni sono risultate in equilibrio di Hardy – Weinberg (HWE) mentre le rimanenti deviaviano dall’equilibrio probabilmente per la presenza di alleli nulli e per un eccesso di eterozigosi. Il pattern di variabilità genetica osservato tra le popolazioni da campo utilizzando la statistica-F, sembrerebbe essere influenzata dal flusso genico, con la possibile concausa della presenza di vari punti di rifugio che possono contribuire ad incrementare la variabilità delle popolazioni. Il dendrogramma, mostra alcune popolazioni legate geograficamente, mentre altre in clustering per similarita’ nel pattern di resistenza.Cio’ potrebbe suggerire che la pressione selettiva esercitata dagli agrofarmaci è una delle forze unificanti che probabilmente prevale sulle forze diversificanti come la distanza geografica o deriva genetica. Infine, l'analisi di Linkage disequilibrium ha messo in evidenza la presenza di alcuni microsatelliti in linkage con i loci della resistenza per il Kdr e il recettore nicotinico R81T. Pertanto questi loci potrebbero essere usati come marker per tracciare qualche tratto fenotipico associato con la resistenza. Le linee clonali sono risultate prive di variabilità genetica intrapopolazione. D’altra parte il test di Mantel ha messo in evidenza una debole ma significativa correlazione interpopolazione tra variabilità genetica e distanza geografica suggerendo che la divergenza tra le popolazioni osservate potrebbe essere causata da isolamento geografico.
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Abstract
The focus of my PhD thesis consists on the study of the genetic variability in the peach potato aphid Myzus persicae by means of both cytogenetic and molecular approaches. This aphid species is one of the more serious pest on a wide range of agricultural and horticultural crops, mainly due to its ability to transmit plant viruses. This species is also very interesting for cytogenetics due to the presence of holocentric chromosomes which allow the occurrence of chromosomal rearrangements, some of which have been associated with the onset of insecticides resistance. My studies carried out by means of fluorescent in situ hybridization experiments combined with chromosome length measurements, revealed the presence of both inter and intra individual rearrangements involving chromosomes X, 1 and 3. Contrary to what generally reported in the literature, X chromosomes were frequently involved in recurrent fragmentations, in particular at their telomeric ends opposite to the nucleolar organizer region.The recurrent fissions of the same chromosomes in the same regions, suggested that M. persicae genome possesses fragile sites that are at the basis of the observed changes in chromosome number. The presence of holocentric chromosomes and the reproduction by apomictic parthenogenesis, together with a higher telomerase expression level, favoured the stabilization of the observed chromosome instability. The high telomerase activity, making chromosomal fragmentations more common than fusions, could also explain why M. persicae populations present more frequently an increase rather then a reduction of the chromosomal number. In order to a deeper characterization of these rearrangements I generated an X chromosome painting probe. Unfortunately, the FISH with the X-chromosome probe showed ambiguous results. Indeed the X-probes exhibited a scattered hybridization signals on X chromosome focused on heterocromatic and telomeric areas suggesting that the probes works but is not able to paint the X chromosomes along their entire lenght. Finally, I also performed a microsatellite analysis, useful for a deeper investigation on M. persicae populations’ structure. I tested 12 aphid field populations, together with 55 strains reared in lab for many years. In the first case all microsatellite loci analysed were variable, presenting 6-25 alleles for locus and 2-12 alleles for population.Three populations were at the Hardy Weinberg-equilibrium (HWE), the remaining ones were in HWE for some loci but not for the others. The deviations from HWE were probably linked to the presence of null alleles and heterozygote excess. Moreover, the migration rate is probably another parameter able to affect HWE because it could induce a deep change of allele frequencies. The Neighbor-Joining dendrogram computed on Nei distance shows that whereas, as expected, some populations are related due to geographic vicinity others are clustered together on the basis of resistance pattern, independently from their geographical origin. This could suggest that the selection pressure is a unifying forces that probably prevails over the diversifying forces as the geographical distance or genetic drift. Finally, the linkage disequilibrium analysis has shown that some microsatellite loci are in linkage with the Kdr and R81T resistance loci. Therefore these loci could be used as a marker to trace some phenotypic trait associated with the resistance. As regards the clonal lineages, no intra-population genetic variation was found. Despite that, the Mantel Test put in evidence a weak but significant positive correlation between inter population genetic variability and geographic distance.
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