Riassunto analitico
Il Rabdomiosarcoma (RMS) è il più comune sarcoma dei tessuti molli in età pediatrica, vi sono due maggiori sottotipi: embrionale ed alveolare. Le cellule di RMS sono mioblasti scheletrici, esprimono alti livelli di fattori di trascrizione miogenici, sono tuttavia incapaci di eseguire un completo programma di differenziamento e proliferano senza controllo. Il differenziamento del muscolo scheletrico è controllato principalmente da due famiglie di fattori trascrizionali: i determinanti miogenici bHLH (basic-Helix Loop Helix) e le proteine della famiglia MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2). Il fattore MEF2C è importante per l’attivazione di un programma genico di differenziamento nelle cellule di muscolo sano. Esso regola la sua attività grazie ad un meccanismo di splicing alternativo tra due esoni mutualmente esclusivi: l’esone α1 espresso in modo ubiquitario induce proliferazione cellulare e l’esone α2 muscolo specifico induce differenziazione muscolare. Questo meccanismo è alterato nel RMS dove il rapporto α1/α2 è aumentato. L’esone α1 modula la sua attività in maniera fosforilazione dipendente, presenta due siti (Ser98-Ser110) la cui fosforilazione è fondamentale per la regolazione del ciclo cellulare e il legame con cofattori che riducono la sua attività pro-differenziativa. L’isoforma α1 fosforilata oltre ad inibire il differenziamento muscolare potrebbe svolgere in RMS un ruolo attivo di promozione dell'espansione cellulare attivando l'espressione di oncogeni o inibendo quella di oncosoppressori. Per capire come MEF2C possa influenzare la proliferazione abbiamo focalizzato la nostra attenzione su due suoi potenziali bersagli: TOB1 (Transducers of ERBB2.1) e la pathway IGF1/AKT/mTOR. Il gene anti-proliferativo TOB1 è diminuito nel RMS rispetto al muscolo sano, è un oncosoppressore che agisce come regolatore negativo del recettore tirosin-chinasico ERBB2. Studi di immunoprecipitazione della cromatina mostrano che la proteina MEF2Cα1 è in grado di legarsi ad una regione promotrice per il gene codificante TOB1, suggerendo che quest’ultimo possa essere un gene bersaglio di MEF2C in grado di mediarne l’attività pro-proliferativa. L’obbiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare l’interazione tra MEF2Cα1 e TOB1 in cellule di RMS e analizzare la modulazione della pathway PI3K/AKT. A livello trascrizionale vi è una diminuzione del trascritto di TOB1 in seguito a sovraespressione dell’isoforma α1 in cellule RD, viceversa il silenziamento del trascritto di MEF2C in cellule RH30 determina un aumento del trascritto di TOB1. Abbiamo osservato come l'espansione MEF2C-dipendente di cellule RD viene annullata dalla contemporanea espressione di TOB1. Infine i dati suggeriscono che alla base del meccanismo pro-proliferativo di MEF2C sia coinvolta la via di PI3K/AKT/mTOR: cellule RH30 silenziate per MEF2C mostrano una diminuzione di fosforilazione di AKT. Per confermare il coinvolgimento di tale via abbiamo utilizzato l’inibitore NVP-BEZ235 (Dactolisib) che agisce bloccando specificatamente la PI3K e mTOR. Saggi di vitalità cellulare dopo trattamento con inibitore hanno mostrato nelle cellule trasfettate con l’isoforma α1 una maggiore resistenza. Confermata l’influenza di MEF2C α1 abbiamo analizzato anche la modulazione di TOB1 sulla pathway dato che tra le sue funzioni antagonizza AKT, ad un suo aumento è stata infatti osservata l’attivazione di altre proteine oncosoppressori come PTEN10 regolatore negativo della pathway PI3K/AKT. L’overespressione di TOB1 assieme ad α1 porta ad una diminuzione di AKT totale e di conseguenza della sua fosforilazione. Infine abbiamo osservato in via preliminare un effetto di cross-regolazione di TOB1 su MEF2C. Questi dati se confermati, potrebbero aprire la strada per combattere la farmaco-resistenza ai chemioterapici che nel RMS viene spesso correlata all'attivazione della via PI3K/AKT/mTOR.
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