Riassunto analitico
Questo progetto è stato realizzato presso il Gruppo CIGMH - Nanotheranostics della Faculdade de Ciencias e Tecnologias da Universidade Nova de Lisboa , dove un nuovo vettore genico è stato studiato e sviluppato , utilizzando nanoparticelle d'oro di 14 nm , funzionalizzate con differenti polimeri e peptidi . Il miglior rapporto tra il vettore e il plasmide o siRNA è stato studiato utilizzando un'analisi di elettroforesi su gel di agarosio . Il nuovo complesso è stato utilizzato per veicolare il plasmide contenente EGFP in cellule HepG2 e il siRNA contro EGFP in cellule MCF-7 trasfettate con EGFP in precedenza . EGFP è stato usato come gene reporter , ma lo scopo finale dello studio è quello di utilizzare i vettori per terapia diretta contro altri geni come ADAM 17 , EGFR e altri geni coinvolti nella carcinogenesi . In particolare , le tecniche utilizzate per il progetto sono state dapprima l'ottimizzazione di PCR per i geni di interesse ( ADAM 17 , e geni reporter come GAPDH e integrine ), la sintesi di nanoparticelle di oro di 14 nm, l'aggiunta di PEG sulla loro superficie e la loro funzionalizzazione con protamina e altre molecole .Il plasmide è stato ottenuto da una coltura batterica e quindi la formazione del complesso tra plasmide e nanoparticelle di oro funzionalizzate è stata analizzata utilizzando un gel di agarosio . È stato eseguito lo stesso esperimento su elettroforesi su gel di agarosio , ma utilizzando siRNA invece di plasmide , per conoscere il miglior rapporto tra questi 2 componenti . Le nanoparticelle e tutte le altre molecole che sono state utilizzate per studiare la formazione del complesso hanno un peso molecolare più elevato del plasmide/siRNA , in modo che quando essi sono attaccati al plasmide o al siRNA è possibile osservare uno spostamento nella banda plasmide/siRNA sul gel , perché è legato alla particella e peso più . Poi , le cellule sono state trasfettate con il vettore , con gli stessi rapporti utilizzati per lo studio gel . Sono state effettuate colture cellulari delle linee HepG2 e MCF -7. Per studiare la trasfezione con plasmide è stata utilizzata la linea cellulare HepG2 e l'aumento di fluorescenza è stato verificato con spettrometro a fluorescenza . Per studiare la trasfezione con siRNA è stata utilizzata la linea cellulare MCF -7 che esprime EGFP (precedentemente trasfettata) e la diminuzione della fluorescenza è stata verificata in spettrometro a fluorescenza . Come controllo positivo per la trasfezione è stata utilizzata Lipofectamine 2000 . Non sono stati ottenuti risultati positivi per la trasfezione con plasmide , un aumento di fluorescenza non è stato osservato , ma per la trasfezione con siRNA una leggere diminuzione di fluorescenza è stata osservata utilizzando solo protamina o dendrimeri . Probabilmente le nanoparticelle di 14 nm non sono abbastanza grandi per legare una quantità sufficiente di protamina e di altre molecole e non possono portare il plasmide che è abbastanza grande . Ulteriori studi devono essere effettuati per sapere meglio come queste molecole interagiscono con il DNA e per trovare la migliore condizione per la trasfezione . Poi , studi sulla citotossicità devono essere condotti per sapere se questi complessi possono essere utilizzati come un nuovo vettore , meno tossico della lipofectamina .
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Abstract
This project was carried out at the CIGMH-Nanotheranostics Group of the Faculdade de Ciencias e Tecnologias da Universidade Nova de Lisboa, where a new gene delivery vector was studied and developed, using 14 nm gold nanoparticles, functionalized with different polymers and peptides. The best ratio between the vector and the plasmid or siRNA has been investigated using an agarose gel electrophoresis analysis. The new complex has been used to deliver plasmid containing EGFP on HepG2 cells and to deliver siRNA against EGFP on MCF-7 cells previously transfected with EGFP. EGFP has been used as a reporter gene, but the final purpose of the study is to use the vectors for therapy directed against other genes like ADAM 17, EGFR and other genes involved in carcinogenesis.
In particular, the techniques used for the project were first the optimization of PCR for the genes of interest (ADAM 17, and reporter genes like GAPDH and integrins) the synthesis of 14 nm gold nanoparticles, addition of PEG on their surface and functionalization of them with protamine and other molecules. Plasmid was obtained from a bacteria culture and then the formation of the complex between plasmid and functionalized gold nanoparticles was analysed using an agarose gel electrophoresis. The same experiment on agarose gel electrophoresis was performed, but using siRNA instead of plasmid, to know the best ratio between those 2 components. The nanoparticles and all the other molecules that were used to study the complex formation have a higher molecular weight, so when they are attached to the plasmid or to the siRNA is possible to observe a shift in the plasmid/siRNA band on the gel, because the plasmid/siRNA is attached to the particle and weight more.
Then, the cells were transfected with the vector, with the same ratios used for the gel study. Cell cultures of HepG2 and MCF-7 cell lines were made. To study the plasmid transfection was used the HepG2 cell line and the increase of fluorescence was checked on the fluorescence spectrometer. To study the siRNA transfection was used the MCF-7 cell line expressing EGFP (previously transfected) and the decrease of fluorescence was checked on the fluorescence spectrometer. As positive control for transfection lipofectamine 2000 was used.
Positive results weren’t obtained for the plasmid transfection, an increase of fluorescence for the plasmid was not observed, but for siRNA trasfection a slightly decrease of fluorescence was observed using only protamine or dendrimers.
Probably the 14 nm nanoparticles are not big enough to bind a sufficient amount of protamine and other molecules and cannot carry the plasmid that is quite big.
More studies have to be carried on to know better how those molecules interact with DNA and to find the best condition for transfection. Then, studies about cytotoxicity have to be performed to know if those complexes can be used like a new vector, less toxic than lipofectamine.
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