• anisotropy assay
• expression proof
• hit discovery
• virtual screening
• YAP-TEAD interaction

L'interazione YAP-TEAD è stata recentemente annoverata tra gli argomenti di recente interesse farmaceutico per la scoperta di piccole molecole sia ad azione terapeutica nel trattamento di forme tumorali solide sia come strumenti per la medicina rigenerativa. Nonostante i progressi degli ultimi anni, i tentativi di bersagliare l’interfaccia di TEAD comunicante con l’Ω-loop di YAP sono stati ostacolati dalla complessità di questa interazione proteina-proteina e dalla mancanza di potenti inibitori sintetici. A partire dalla libreria ChemDiv, comprendente composti con proprietà specificatamente ritenute in grado di disturbare le interazioni proteina-proteina, un virtual screening comprendente metodi di progettazione structure-based e ligand-based ha condotto all’ottenimento di 50 potenziali candidati per la cavità di hTEAD1 ospitante l’Ω-loop di YAP.
Con l’obiettivo di valutare il potenziale anti-proliferativo, questi nuovi hit sono stati testati sulla linea di carcinoma del colon-retto HT29 e sulla linea di tumore ovarico A2780. I sei migliori composti hanno conseguito IC50 nell’ordine dell’alto-micromolare in saggi di cell viability e sono stati testati ulteriormente sulla linea di tumore al colon HCT116, oltre ad essere ritenuti idonei per ulteriori studi in silico. Con lo scopo di ottenere altre molecole potenzialmente attive, la libreria ChemDiv precedentemente preparata e filtrata è stata sottoposta per una seconda volta a virtual screening per ottenere molecole simili e potenzialmente attive attraverso studi di similarità e di docking. Inoltre, al fine di valutare la stabilità del complesso di hTEAD1 con i sei hit compounds, simulazioni di dinamica molecolare sono state eseguite.
Prove di sovra-espressione del costrutto ricombinante GST-hTEAD4 in ospite batterico sono state svolte con l’obiettivo di identificare condizioni ottimali per l’isolamento della proteina target per procedere con saggi biochimici. Con queste aspettative, un saggio di spiazzamento basato sulla spettroscopia di fluorescenza è stato messo a punto per testare l’affinità dei candidati selezionati per questo sito. Come risultato preliminare, le anisotropie in emissione e in eccitazione del composto identificato sono aumentate a seguito dell’interazione con albumina sierica umana. Questo ritrovamento è ritenuto idoneo allo sviluppo di un saggio nel quale lo spiazzamento di questo ligando dalla cavità di TEAD è rilevabile dal decremento dei livelli di anisotropia.

The YAP-TEAD interaction has been recently reported as a hot topic for the discovery of small molecules as both treatment for solid malignancies and tools for regenerative medicine. Despite advances in the last decade, attempts to target the TEAD interface contacting the YAP Ω-loop have been hindered by the complexity of this protein-protein interaction and the lack of potent synthetic inhibitors. Starting from the ChemDiv library, encompassing compounds specifically bearing properties believed to hamper protein-protein interactions, a virtual screening with both structure-based and ligand-based drug design methods previously led to 50 potential candidates targeting the cavity accommodating the YAP Ω-loop on the surface of hTEAD1. To evaluate their potential antiproliferative effect, these new hits were screened on colorectal cancer cell line HT29 and ovarian cancer cell line A2780. The best six compounds showed high micromolar IC50 in cell viability assays and were also tested on human colon cancer cell line HCT116 and directed to further computational studies. In order to select other potentially active compounds, the ChemDiv library previously prepared and filtered was screened for a second time to select other similar and potentially active compounds by combining a 2D-similarity search and docking studies. Moreover, in order to evaluate the stability of the complex between hTEAD1 and the six hit compounds, molecular dynamics simulations were also performed. Recombinant GST-hTEAD4 over-expression experiments in bacterial host were also conducted with the aim of identifying optimal conditions for protein harvesting to proceed with biochemical assays. With these expectations, a fluorescence-based displacement assay for testing the affinity of the selected candidates was designed. As a first result, emission and excitation anisotropies of the designated compound were observed increasing following binding to human serum albumin. This finding is expected to open the way for developing an assay in which the displacement of this ligand from the TEAD cavity is revealed by decrease in anisotropy levels.