Riassunto analitico
La metabolomica è una scienza emergente, con promettenti applicazioni in campo medico e diagnostico. L'approccio metabolomico consiste in una identificazione globale dei componenti di un campione, non supportata da ipotesi a priori, quali quelli presenti in un fluido biologico. Ciò porta determinazione di un profilo metabolico di un campione in esame. In particolare, la metabolomica consente di determinare i biomarkers responsabili di una determinata patologia e di identificare i metaboliti o pattern di metaboliti utili come discriminanti tra differenti gruppi di studio. Lo studio del profilo metabolomico si avvale di due approcci differenti. L’approccio untargeted prevede l’analisi globale degli analiti misurabili di un campione, senza avere conoscenze pregresse dello stesso. L’approccio targeted, normalmente effettuato in seguito a quello untargeted, permette un’analisi mirata dei metaboliti riconosciuti come potenziali biomarkers, ossia composti biologicamente rilevanti. Lo scopo di questo studio è stato quello di potenziare un metodo LC/MS-MS per l’identificazione di più di 200 metaboliti ad alta polarità in campioni biologici di interesse. A tale fine, sono stati analizzati una serie di campioni standard per determinare le condizioni di detection ottimali degli analiti. Successivamente, l’obiettivo del progetto è stato quello di applicare l’analisi metabolomica e la spettrometria di massa alla determinazione dei metaboliti presenti nel plasma di pazienti affetti da una rara malattia congenita, l’adrenoleucodistrofia. Il progetto ha previsto di lavorare con campioni standard e campioni biologici, l’acquisizione dei relativi dati analitici, nonché di quelli biochimici, per ottenere dati utili e riconducibili ai diversi fenotipi della malattia oggetto di indagine. L’analisi quantitativa in LC-MS/MS è stata migliorata per rilevare 230 composti, in particolare per quantificare metaboliti polari endogeni presenti nel plasma umano, utilizzando una scansione MRM dinamica. Il metodo è stato applicato a 29 campioni di plasma, dei quali 15 campioni controllo e 14 campioni di plasma di pazienti affetti dalla malattia. Solo 51 metaboliti hanno prodotto dati quantitativi accettabili, mentre non è stato possibile quantificare gli altri metaboliti a causa della bassa intensità dei segnali. In base ai risultati, pochi metaboliti tra quelli misurati hanno mostrato differenze significative tra i pazienti affetti da AMN e i pazienti sani. La patologia è strettamente correlata al metabolismo degli acidi grassi a lunga catena, e, dai risultati ottenuti, è possibile notare che l’alterazione di questo metabolismo non induce differenze nei metaboliti polari che si possono rilevare nel plasma. Tuttavia, acido piruvico, 2-metil-1-butanolo, creatina and acido 4-piridossico sono emersi come composti significativi nella differenziazione tra i due gruppi, ciò significa che l’effetto dell’alterazione del metabolismo degli acidi grassi a lunga catena può estendersi nelle vie metaboliche in cui questi composti sono coinvolti. L’implementazione di questo metodo ha dimostrato che la separazione cromatografica IP-RP fornisce un metodo riproducibile e robusto, che permette la separazione dei metaboliti anionici e polari. Inoltre, la modalità in MRM dinamico ha permesso una veloce e accurata quantificazione dei metaboliti in LC/MS. Il metodo ottimizzato ha permesso di identificare e quantificare alcuni potenziali differenze tra i pazienti affetti da AMN e i pazienti sani, anche se non è stato possibili rilevare tutti i metaboliti.
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Abstract
Metabolomics is an emerging science, with promising application in medical practice and diagnostic. The metabolomic approach is based on the global identification, not driven by a priori hypothesis, of many metabolites in a biological fluid. This leads to a molecular characterisation, thus to determination of a metabolomic profile of samples. Metabolomics makes it possible to determine biomarkers responsible for a particular disease and to identify metabolites or pattern of metabolites that could be useful in discriminating different groups of subjects. The study of metabolic profile uses two different approaches. The untargeted approach provides for a global analysis of measurable analytes in a sample, without a previous knowledge of its composition. The targeted approach, usually performed following the untargeted one, allows for a focused analysis of metabolites identified as potential biomarkers, i.e. compounds with a biologically relevant significant.
The aim of this study was the implementation of a LC/MS-MS method for the identification of more than 200 highly polar compounds of biological interest. To do that, several standards were analysed to find the best detection conditions. Subsequently, the purpose of this project was to apply metabolomic analysis and mass spectrometry to evaluate and quantify metabolites in plasma of patients with a rare congenital disorder, called adrenoleukodystrophy. The project involved working with standards and biological samples, evaluation of analytical results, as well as biochemical interpretation of data to obtain conclusions related to the feasibility of the implemented method and to relate the findings with the phenotype of patients.
The quantitative LC-MS/MS assay was implemented to detect 230 compounds, especially to quantify endogenous polar metabolites present in human plasma, using a dynamic MRM approach. The method was applied to 29 plasma samples, 15 controls and 14 AMN patients. Only 51 metabolites produced acceptable quantitative data. Other compounds were not quantified because of the low intensity detected. Few compounds of all those measured were significantly different among AMN patients and healthy controls.
The disease was found to be strongly related to the metabolism of very long fatty acids, and the results showed that the alteration of this metabolism did not induce differences in most of the polar compounds that can be detected in plasma. Nevertheless, pyruvic acid, 2-methyl-1-butanol, creatine and 4-pyridoxic acid showed significant differences between both groups, which means that the effect of the alteration of the metabolism of very long fatty acids can extend to the metabolic pathways where very polar compounds are involved.
The results demonstrated also that the improved IP-RP chromatographic method is reproducible and robust, and that it provides separation of anionic and high polar metabolites. Furthermore, the dMRM mode allowed the optimization of this methodology and a fast and accurate LC/MS quantitation of metabolites.
The method implemented allowed the determination of some potential differences between AMN patients and controls, even if it was not possible be possible detect all the metabolites.
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