Riassunto analitico
Le proteine SHANK rappresentano una famiglia di proteine strutturali multidominio localizzate a livello della densità postsinaptica delle sinapsi glutammatergiche, dove sono coinvolte in diverse funzioni sinaptiche. Queste proteine sono codificate da 3 geni: SHANK1, SHANK2 e SHANK3. Le proteine SHANK furono inizialmente scoperte nel cervello, sebbene SHANK2 e SHANK3 siano state, in seguito, identificate anche in vari altri tessuti.
La perdita (delezione) della porzione terminale (q13) del cromosoma 22 (delezione 22q13) comporta la perdita di una copia del gene che codifica per la proteina SHANK3 (aploinsufficienza). Questa delezione conduce alla sindrome di Phelan-McDermid (PMDS), un disturbo dello sviluppo neurologico caratterizzato da ritardo dello sviluppo globale, ritardo mentale, ipotonia neonatale, sintomi tipici dei disturbi dello spettro autistico e caratteristiche dismorfiche minori, come bassa statura, dismorfismi craniofacciali, pieghe epicantali, naso corto e bulboso. Similmente, in un modello SHANK3 knockout di topo sono state osservate anomalie craniofacciali e perdita nell'osso trabecolare, suggerendo un potenziale ruolo di SHANK3 nella formazione ossea. Inoltre, dati preliminari come un siRNA-screen per i regolatori della differenziazione degli osteoblasti prematuri, e il passaggio dell'espressione di SHANK3 da una localizzazione nucleare a una localizzazione citoplasmatica durante la differenziazione di osteoblasti murini primari, evidenziano ulteriormente il coinvolgimento di SHANK3.
Pertanto, gli obiettivi del mio progetto erano: in primo luogo stabilire e ottimizzare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) in osteoblasti usando un protocollo privo di siero e alimentazione, che può essere trasferito alle linee cellulari di pazienti, adatto per ulteriori analisi; in secondo luogo analizzare l'espressione e localizzazione di SHANK3 negli osteoblasti derivati da hiPSC di pazienti, in riferimento al controllo.
Il processo di differenziazione è stato valutato mediante lo staining della fosfatasi alcalina (ALP), mentre la mineralizzazione ossea è stata dimostrata attraverso lo staining con Alizarina Rossa.
È stata, inoltre, tracciata l'espressione dei principali marcatori osteoblastici (ALP, SP7, RUNX2, COL1A1, IBSP e BGLAP), in diverse fasi del processo di differenziazione tramite RT-PCR quantitativa. Infine, è stata analizzata l'espressione di SHANK3, e di marcatori osteoblastici selezionati, sia a livello trascrizionale che a livello di sintesi proteica negli osteoblasti derivati da hiPSC di pazienti; ed è stata analizzata la localizzazione intracellulare di SHANK3 tramite colorazione immunocitochimica.
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Abstract
SHANK proteins are a family of multidomain scaffolding proteins at the postsynaptic density of glutamatergic synapses, where they are involved in synaptic function. SHANK proteins were discovered in the brain, however SHANK2 and SHANK3 could be identified in various other tissues as well. Deletion of the 22q13 region including SHANK3 leads to Phelan-McDermid syndrome (PMDS) a neurodevelopmental disorder characterized by global developmental delay, intellectual disability, speech delay, neonatal hypotonia, symptoms of Autism spectrum disorders and minor dysmorphic features like short stature, cranial dysmorphias, epicanthal folds and short and bulbous nose. Similarly, in a SHANK3 knockout mouse model craniofacial abnormalities and a trabecular bone loss were observed hinting towards a role if SHANK3 in bone formation. In addition, preliminary data like a siRNA screen for regulators of early osteoblast differentiation along with a switch of SHANK3 expression from a nuclear to cytoplasmic localization during differentiation in primary murine osteoblasts point towards a role of SHANK3.
The aims of my project were: first to establish and optimize the differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSC) into osteoblasts using a feeder-and-serum-free protocol than can be transferred to the patient lines, suitable for further analysis; second to analyze SHANK3 expression and localization in patient hiPSC derived osteoblasts compared to control. Successful differentiation was assessed by alkaline phosphatase (ALP) staining and bone mineralization demonstrated using Alizarin Red Staining. Furthermore appropiate expression of osteoblast markers (ALP, SP7, RUNX2, COL1A1, IBSP and BGLAP) in different stages of differentiation was traced via quantitative RT-PCR. Finally, expression of SHANK2 and selected osteoblast markers on mRNA and protein level was analyzed in PMDS osteoblasts and localization of SHANK3 quantified via immunocytochemical staining.
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