Riassunto analitico
Le proteine MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) rappresentano un’ importante famiglia di fattori trascrizionali espressi in molteplici tessuti in tutti gli eucarioti. Queste proteine sono state scoperte come fattori di trascrizione fondamentali per il differenziamento del muscolo scheletrico, successivamente è stato dimostrato che esse sono espresse anche nel cuore, nei linfociti T e nel sistema nervoso centrale. Nei vertebrati sono presenti quattro isoforme di MEF2: MEF2A, MEF2B, MEF2C e MEF2D, la cui attività è finemente regolata attraverso numerosi meccanismi; in particolare l’ attività di MEF2C è regolata a livello trascrizionale, post-trascrizionale e post-traduzionale. La sua regolazione mediante splicing alternativo del trascritto porta a due isoforme: α1 espressa in modo ubiquitario e α2 muscolo-specifica; modificazioni post-traduzionali in α1 interessano due siti fosfo-accettori: Ser98 e Ser110. Queste modificazioni covalenti, individuate precedentemente nel nostro laboratorio attraverso studi di spettrometria di massa, sono molto importanti nel regolare l’ equilibrio tra proliferazione e differenziamento dei precursori del muscolo scheletrico sano: la fosforilazione di queste due serine si è dimostrata un meccanismo fondamentale per la progressione della cellula nel ciclo cellulare, in particolare nella transizione G2/M e per l’ interazione con la peptidil-prolil-cis/trans isomerasi (PIN1) che riconosce motivi Ser/Thr-Pro (di cui queste due serine fanno parte). Dati del nostro laboratorio suggeriscono come questo meccanismo molecolare sia alterato in patologie quali tumori (Rabdomiosarcoma) e distrofie muscolari, in cui l’ equilibrio proliferazione/differenziamento è sbilanciato. Affermata l’ importanza di questo meccanismo di regolazione post-traduzionale, si è tentato di comprenderne le basi indagando su quali chinasi siano responsabili della fosforilazione di Ser98 e Ser110. Da saggi di fosforilazione in vitro su ampia scala (190 diverse Ser/Thr chinasi) è stato verificato che Ser110 è un potenziale substrato delle chinasi CDK5/p35 e CDK6/CycD1, mentre per il residuo Ser98 nessuna delle chinasi testate ha fornito risultati significativi. Inoltre, esperimenti con 14 inibitori chinasici eseguiti precedentemente al mio lavoro di tesi, hanno permesso di individuare 5 possibili chinasi implicate nella fosforilazione di Ser98 e Ser110. Nel corso del mio lavoro di tesi ho valutato l’ effetto degli inibitori chinasici, selezionati dalle precedenti analisi, sulla fosforilazione di MEF2C in cellule di Rabdomiosarcoma (RMS); a tale scopo sono state utilizzate cellule di RMS embrionale umane (RD) in quanto dati di letteratura e indagini svolte nel nostro laboratorio hanno mostrato un’ aumentata espressione dell’ isoforma α1 fosforilata in cellule di RMS umano. In più è stato valutato l’effetto della sovraespressione della chinasi k-Ras (G12V) costitutivamente attivata. Sia gli esperimenti di inibizione che di overespressione hanno confermato un coinvolgimento delle chinasi CDK4/Ciclina D3 e Jun Kinase (JNK) nella fosforilazione di MEF2C su Ser98 e Ser110. Inoltre la pathway RAS/MEK è coinvolta in questo meccanismo di regolazione. Infine abbiamo verificato che Ciclina D3 è anche in grado di influenzare lo splicing alternativo degli esoni α1 e α2. I nostri risultati potrebbero fornire gli strumenti per elaborare nuove strategie terapeutiche volte a modulare la funzione pro-proliferativa di MEF2C nel Rabdomiosarcoma.
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