Riassunto analitico
PIN1 è una Peptidil-prolil cis-trans isomerasi, coinvolta nel controllo post-fosforilazione delle proteine target. Grazie al suo dominio WW all’N-terminale, è in grado di legare i motivi Ser/Thr-Pro se fosforilati in serina (o treonina) e di indurne la isomerizzazione reversibile cis/trans tramite il dominio catalitico al C-terminale (PPIase domain). Il cambiamento conformazionale indotto da PIN1 influenza l’attività delle proteine target attraverso variazione della stabilità proteica, della localizzazione intracellulare etc. Nostri studi pregressi hanno rivelato che una delle proteine bersaglio dell’attività di PIN1 è Myocyte Enhancer Factor 2C (MEF2C), un fattore di trascrizione coinvolto nel processo di differenziamento muscolare: PIN1 lega MEF2C quando quest’ultimo è fosforilato sui residui Ser98 e Ser110; ciò comporta una riduzione della stabilità di MEF2C e di conseguenza della sua funzione di promotore del differenziamento miogenico. Scopo della mia tesi è stato quello di analizzare il comportamento di cellule dal modello murino knock-out per Pin1, per comprendere il ruolo di quest’ultimo in vivo nelle cellule satelliti murine. Le nostre indagini hanno rivelato che gli animali Pin1-/- presentano sia un peso inferiore rispetto al controllo soprattutto nel primo mese di vita, sia una CSA dei singoli muscoli ridotta in età adulta (2-4 mesi). Dato che la crescita muscolare dipende dalle cellule staminali muscolari (cellule satelliti o SC) e che Pin1 è espresso in queste cellule, abbiamo ipotizzato che tali differenze possano essere attribuibili ad una rallentata attività delle staminali in assenza di PIN1. Sono stati condotti diversi esperimenti di doppia immunofluorescenza su fibre isolate estratte da muscolo Extensor Digitorum Longus di topi KO e WT di circa 8 settimane, utilizzando anticorpi diretti contro PAX7, MYOD e Miogenina (MGN) in modo da analizzare la percentuale di cellule satelliti quiescenti (PAX7+MYOD-), proliferanti (PAX7+MYOD+), differenzianti (PAX7-MGN+) o in self-renewal (PAX7+MGN-) a tempistiche diverse dall’isolamento. I risultati ottenuti indicano una minore capacità delle SC ad uscire dalla quiescenza in assenza di Pin1, con conseguente ritardo anche nelle fasi successive. Inoltre nei topi KO sono state riscontrate cellule doppie positive PAX7+/MGN+ a 72 h di coltura, condizione molto rara in SC WT: nelle cellule muscolari l’espressione di PAX7 è mutualmente esclusiva rispetto a quella di MGN, poiché rappresentano marker molecolari di destini cellulari opposti (differenziamento e self-renewal). Per cercare di comprendere il meccanismo molecolare alla base, PIN1 è stato over-espresso in cellule C2C12 (linea di mioblasti murini proliferanti) a concentrazioni crescenti. Western Blot sugli estratti proteici a 48h dalla trasfezione hanno dimostrato un aumento dose-dipendente dei livelli di proteina MYOD, senza variazioni significative dei livelli di trascritto. Silenziando l’espressione di Pin1 tramite due siRNA specifici in C2C12, abbiamo osservato una diminuzione dei livelli di MYOD in modo proporzionale all’efficacia del silenziamento. Globalmente questi dati suggeriscono un effetto stabilizzante di PIN1 sulla proteina MYOD. Esperimenti di co-immunoprecipitazione indicano una interazione fisica di PIN1 con MYOD, condizione necessaria per lo svolgimento della sua attività catalitica. Alla luce dei risultati ottenuti, PIN1 sembrerebbe influenzare l’attività delle cellule satelliti favorendone l’uscita dallo stato di quiescenza, probabilmente mediante un’azione su MyoD, fattore chiave per la progressione del ciclo cellulare.
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