Riassunto analitico
I semi delle orchidee presentano generalmente un comportamento ortodosso, cioè manifestano una buona longevità quando sono disidratati (contenuto di umidità inferiore al 5%) e congelati a -20 °C, condizioni di stoccaggio comunemente applicate nelle Banche dei Semi. Recenti studi hanno però evidenziato alti livelli di variabilità tra le specie ed una vitalità di breve durata nei semi di alcune specie (short-lived species). Da qui la necessità di sperimentare tecniche alternative come la crioconservazione. Nella prima fase della ricerca è stato valutato l'effetto dello stoccaggio in N liquido sulla germinazione in vitro di semi di otto specie di orchidee mediterranee. I semi sono stati anche analizzati all’ESEM per verificare l’effetto dell’immersione in N liquido sui tegumenti dei semi ma nessuna differenza micromorfologica è emersa tra i semi crioconservati e di controllo. La germinazione, dopo il congelamento a -196 °C, è risultata variabile tra le specie e per Ophrys sphegodes ssp. passionis e Orchis mascula ha portato ad un aumento delle percentuali di germinazione. I protocormi di tutte le specie studiate hanno mostrato un trend positivo di crescita, anche se erano evidenti alcune differenze tra le dimensioni dei protocormi derivanti da semi trattati e non trattati. Plantule di tre di queste specie, ottenute da germinazione di semi crioconservati, sono state seguite nel loro sviluppo in vitro fino ad un massimo di venti mesi. In collaborazione con l’Università del Costa Rica è stato testato lo stesso protocollo precedentemente descritto sui semi di due orchidee tropicali: Lycaste bradeorum e Vandopsis gigantea. In L. bradeorum, la vitalità dei semi non è variata dopo lo stoccaggio a diverse condizioni di temperatura, mentre la vitalità dei semi di V. gigantea è diminuita dopo l’immersione in N liquido rispetto al congelamento a -20 °C. Anche in questo esperimento la germinazione dei semi e lo sviluppo dei protocormi in vitro sono risultati variabili tra le due specie e le osservazioni condotte all’ESEM non hanno evidenziato differenze micromorfologiche tra i campioni esaminati. Nella seconda fase, la ricerca è stata affinata studiando quali condizioni di pre-trattamento siano più efficaci per la sopravvivenza dei semi al congelamento/scongelamento. E’ stato testato un nuovo protocollo per la crioconservazione dei semi, previa disidratazione in atmosfera controllata, su L. bradeorum e su una specie mediterranea, Anacamptis laxiflora. Dopo il congelamento dei semi di L. bradeorum in N liquido la vitalità è risultata maggiore se i semi erano stati in precedenza disidratati su CaCl2.2H2O. Per A. laxiflora non è stata evidenziata alcuna differenza significativa dopo i diversi trattamenti. L’attività di ricerca sulla disidratazione dei semi è stata implementata grazie alla collaborazione con i Royal Botanic Gardens, Kew (Millennium Seed Bank – Wekehurst Place, UK). Sono stati studiati i semi di due specie di orchidee terrestri, Orchis mascula ed Himantoglossum robertianum, mettendo a confronto differenti temperature di stoccaggio: +5 °C, -20 °C, -196 °C, e diversi valori di umidità relativa (RH): 5%, 60%, 80%. Il trattamento criogenico ha dato buoni risultati in termini di percentuale di germinazione e sviluppo dei protocormi se combinato con bassi valori di RH. Poiché i risultati fin qui ottenuti hanno dimostrato che la conservazione in N liquido ha grandi potenzialità per lo stoccaggio del germoplasma di orchidee per tempi teoricamente illimitati, si è proceduto con l’allestimento della CrioBanca UNIMORE per lo stoccaggio di semi di orchidee in N liquido. I semi sono stati raccolti nel giugno 2013 e nel periodo aprile-ottobre 2014 da popolazioni di sette stazioni in Toscana e tredici stazioni tra le Province di Modena e Reggio Emilia. Complessivamente sono stati raccolti e stoccati in N liquido semi di 27 specie per complessive 39 accessioni.
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Abstract
Orchid seeds are considered to display an orthodox behaviour and show generally an extended longevity when subjected to a drying treatment (moisture content lower than 5%) and freezing at -20 °C, that is the condition commonly applied in many Seed Banks. Recent studies revealed that large differences in seed viability occur among orchid species during the storage and a short viability in seeds of some species (short-lived species). Hence, the need to test and compare alternative techniques such as cryopreservation.
In the first phase of the research, the effect of liquid nitrogen (LN) on seed germination and protocorm development of eight Mediterranean orchid species was evaluated. An ESEM analysis was conducted to investigate the effect of the immersion in LN on seed integuments. The germination percentages varied on the basis of the species. For the two species Ophrys sphegodes ssp. passionis and Orchis mascula, freezing resulted in a increase of germination percentages. No micro-morphological differences emerged between cryopreserved and untreated seeds. Overall, protocorms of all the studied species showed a positive growth trend, although some differences in protocorms size occurred among the protocorms derived from treated and untreated seeds. Plantlets of three species, from cryo-preserved seeds, were followed during the development up to a maximum of twenty months.
An international collaboration with the University of Costa Rica allowed to test the same protocol on mature seeds of two tropical orchids: Lycaste bradeorum e Vandopsis gigantea. In L. bradeorum, seed viability did not show any significant difference after the storage at different temperature conditions, while the seeds viability of V. gigantea decreased after dipping in LN, compared to freezing at -20 °C. Also in this experiment, in vitro seed germination and protocorms development varied in dependency on the species. Observations conduced at ESEM on the seed coats did not reveal micro-morphological differences among the examined samples.
In the second phase, research about the cryogenic techniques was refined testing which is the most effective pre-treatment for seed survival after freezing in LN and thawing. A new protocol for seed cryopreservation of L. bradeorum and the Mediterranean species Anacamptis laxiflora after dehydration in controlled atmosphere was carried out. In L. bradeorum the viability percentage was higher if seeds were previously subjected to a dehydration treatment with CaCl2.2H2O. For A. laxiflora no significant difference occurred after the different dehydration treatments.
The research on optimal seed dehydration has been implemented thanks to the collaboration with Royal Botanic Gardens, Kew (Millennium Seed Bank – Wakehurst Place, UK). The aim of this study was to establish the best conditions for seeds conservation of two terrestrial orchid species: Orchis mascula and Himantoglossum robertianum, comparing different seed storage conditions: + 5 °C, -20 °C and -196 °C and different values of relative humidity (RH): 5%, 60% and 80%. The cryogenic treatment gave good results in terms of seed germination and protocorm development, if combined with low RH values.
As the results here obtained demonstrated that cryopreservation have a great potential in orchid germplasm conservation, for a theoretically unlimited time, it has been possible to proceed with the applied phase of the research: the development of the Cryo Bank (CrioBanca UNIMORE) for the storage of wild orchids seeds in LN. Seeds were collected in June 2013 and April - October 2014, from wild populations of seven stations in Tuscany and thirteen stations in the Provinces of Modena and Reggio Emilia. As a whole, seeds of 27 different species and 39 accessions were collected and stored in LN.
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