Riassunto analitico
Il DNA libero circolante (cfDNA) è costituito da frammenti di DNA genomico che viene rilasciato dalle cellule con meccanismi principalmente di apoptosi e necrosi. Negli individui sani la sorgente principale di cfDNA è l’apoptosi che causa il rilascio principalmente di frammenti multipli di 166 bp mentre nei pazienti affetti da neoplasia l’evento più frequente è la necrosi che causa una digestione casuale e incompleta del DNA generando frammenti di lunghezza variabile. Ad oggi, il cfDNA viene estratto essenzialmente dal sangue (plasma o siero), tuttavia, possono essere utilizzati anche altri fluidi biologici che presentano maggiore specificità d’organo e nei quali può esservi una maggiore concentrazione di cfDNA se confrontata con quella misurata nel sangue. Per le neoplasie prostatiche, è noto che a parte l’antigene prostatico specifico (PSA), non esistono altri marcatori sensibili e specifici, così come che il livello di cfDNA plasmatico è molto basso rispetto a quello di altre neoplasie (polmone, colon): la sua estrazione dal liquido seminale può presentare dei potenziali vantaggi nell’identificazione di un marcatore diagnostico e/o prognostico.
In questa tesi sono presentate due parti di uno studio inerente il ruolo del cfDNA quale marcatore di neoplasia prostatica. Una prima parte della ricerca è stata condotta sul plasma sanguigno: sono stati arruolati 47 individui, dei quali 32 con diagnosi istologica di cancro prostatico (CP) e 15 sani quale popolazione di controllo. L’estrazione del cfDNA dal plasma, ottenuto in seguito a due cicli di centrifugazione, è stata effettuata utilizzando il kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen). Il cfDNA estratto è stato quantificato utilizzando tre metodiche basate rispettivamente sulla spettrofotometria (Nanodrop), fluorimetria (Qubit utilizzando il kit per quantificare il DNA a singolo filamento e il DNA a doppio filamento) e qPCR (gene APP). Il saggio mediante Qubit ssDNA si è mostrato un metodo sensibile per la quantificazione del cfDNA totale.
La seconda parte della ricerca è stata condotta sul liquido seminale per quantificare e caratterizzare la presenza di cfDNA in 30 pazienti con cancro alla prostata, 33 pazienti con iperplasia prostatica benigna (IPB) e 21 soggetti sani. L’estrazione del cfDNA dal plasma seminale, ottenuto in seguito a due cicli di centrifugazione, è stata condotta utilizzando il kit QIAmp Circulating Nucleic Acid e la quantificazione tramite il Qubit con saggio per ssDNA. La frammentazione del DNA circolante è stata analizzata utilizzando la tecnica di elettroforesi automatizzata mediante Bioanalyzer 2100 (Agilent). La concentrazione media del cfDNA nel plasma seminale (863,32 ± 1130,38 ng/mL) si è mostrata notevolmente più alta rispetto a quella presente nel plasma sanguigno (20,38 ± 12,02 ng/mL) dei pazienti con cancro alla prostata e significativamente differente da quella dei pazienti con IPB (404,49 ± 671,45 ng/mL) e dei soggetti sani (49,40 ± 53,45 ng/mL). L’analisi della frammentazione del DNA nei pazienti con CP ha mostrato una differenza significativa circa la presenza di frammenti ad alto peso molecolare rispetto a pazienti con IPB e ai controlli.
Questa ricerca ha evidenziato che la quantificazione e qualificazione del cfDNA totale ha una correlazione diretta con quello tumorale e può essere utilizzato quale biomarcatore per la neoplasia della prostata sia quando estratto dal sangue che dal liquido seminale. In quest’ultimo caso la concentrazione risulta molto più elevata e con uno specifico pattern di frammentazione che permette di ritenere questo fluido biologico potenzialmente utile anche per la diagnosi differenziale tra CP e IPB.
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