Riassunto analitico
L’ormone follicolo-stimolante (FSH) media lo sviluppo e la riproduzione agendo attraverso il suo recettore (FSHR) accoppiato a proteina G ed espresso nell’ovaio. Recenti studi hanno dimostrato l'esistenza di interazione tra FSHR e il recettore di membrana degli estrogeni (GPER), quale meccanismo per la modulazione di vie di trasduzione del segnale FSH-mediate. GPER inibisce l’accumulo intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) classicamente attivata da FSH. Tale effetto viene prevenuto mediante trattamento cellulare con inibitori della dinamina, i quali risultano nel blocco dell’internalizzazione dei recettori di membrana, suggerendo che il trafficking di FSHR sia implicato nella modulazione dei segnali dipendenti da FSH.
Lo scopo di questa tesi è valutare se l’internalizzazione del complesso FSHR/GPER sia necessaria affinché FSH induca attivazione della via di trasduzione del segnale cAMP/proteina chinasi A (PKA).
La linea cellulare Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) è stata trasfettata con plasmidi codificanti FSHR e GPER. Le cellule over-esprimenti tali recettori sono state trattate con FSH, in presenza o in assenza dell’inibitore della dinamina “Dynasore”.
L’interazione tra FSHR e la proteina Gαs, nonché i livelli intracelllari di cAMP, sono stati analizzati mediante bioluminescence resonance energy transfer (BRET), in cellule esprimenti o meno GPER. La fosforilazione di cAMP response element-binding protein (CREB) è stata valutata mediante Western blotting, mentre l’attività del promotore CRE con saggio della lucferasi.
L’espressione di GPER interferisce con l’accoppiamento tra FSHR e proteina Gαs, funzione che non cambia in presenza di Dynasore. In cellule co-esprmenti FSHR e GPER, il trattamento con FSH risulta nella riduzione dei livelli di fosforilazione di CREB, mentre il trattamento con Dynasore ne aumenta l’attivazione. Tali risultati riflettono l’inibizione dell’attività di CRE indotta, da FSH.
Questi dati dimostrano che GPER moduli negativamente e in maniera allosterica le vie di trasduzione del segnale dipendenti da FSHR, inibendo l’attivazione di cAMP, pCREB e CRE. Poiché tale meccanismo viene contrastato dalla presenza di Dynasore, esso avviene mediante internalizzazione del complesso FSHR-GPER. Questi risultati contribuiscono a nuove prospettive per meglio comprendere il ruolo di GPER nella modulazione della risposta all'FSH nell’ambito della fisiologia ovarica.
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