Riassunto analitico
La presente Tesi Sperimentale di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stata realizzata nell’ambito del programma Erasmus+ tra il Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia e la Facoltà di Farmacia dell’Università CEU San Pablo di Madrid (coordinatore Prof. Federica Pellati). L’attività sperimentale della seguente ricerca è stata svolta presso i laboratori del “Center for Metabolomics and Bioanalysis” (CEMBIO), sotto la supervisione scientifica dei Proff. Antonia Garcia Fernandez e Ma Fernanda Rey-StolleValcarce.
Nel campo della Metabolomica la gas cromatografia accoppiata a spettrometria di massa è un importante strumento nelle analisi untarget, poiché capace di coprire una vasta gamma di composti. Questo tipo di piattaforma analitica fornisce una grande quantità di dati che devono essere processati e, fino ad oggi, tutta la letteratura e i protocolli di analisi si basano sull’utilizzo di strumenti come librerie e database, caratterizzati dall’avere frammenti con massa nominale. Tuttavia, nonostante l’avvento di nuovi strumenti con risoluzione esatta della massa e il loro progressivo miglioramento in termini di accuratezza, non è stato ancora affrontato il problema di un avanzamento delle tecniche di trattamento dei dati.
La presente tesi è stata finalizzata alla realizzazione di una libreria di spettri con massa esatta ottenuti tramite analisi di campioni biologici e standard puri, con GC-MS-QTOF ad alta risoluzione, al fine di mettere a punto una nuova metodologia di trattamento dei dati che tragga vantaggio dalla presenza della massa esatta di ciascun frammento spettrale.
Per la realizzazione della suddetta libreria sono stati analizzati più di 70 composti standard puri e, in una seconda fase, i composti sono stati estrapolati anche da matrici complesse come plasma, fegato, reni ed encefalo di criceto.
Nella fase di identificazione è stato sperimentato un nuovo algoritmo per l’eleaborazione dei dati denominato “Sure Mass” e fornito da Agilent Technologies,incorporato nel software Unknown Analysis, progettato per sfruttare al meglio le nuove capacità degli strumenti a massa esatta. I parametri sono stati messi a punto analizzando un campione di plasma generico e processando i dati in parallelo con il metodo della Deconvoluzione e Sure Mass. Una volta verificata l’efficacia del nuovo metodo, questo è stato applicato a uno “Standard Reference Material 1950”, plasma certificato fornito da NIST per la validazione di nuove metodologie di analisi. È stata quindi preparata una serie di 10 campioni che sono stati analizzati e successivamente processati con entrambi i metodi di Deconvoluzione e Sure Mass, abbinati alla ricerca nella libreria PCDL.
Il nuovo metodo si è dimostrato efficace e affidabile nell’aumentare il numero di composti identificati e, nella maggior parte dei casi, con la libreria di massa esatta.
Si è proseguito poi con l’allineamento dei dati per la successiva fase di quantificazione, generando due metodi: uno con la matrice di dati provenienti dalla Deconvoluzione e uno con quelli di Sure Mass.
Durante la revisione dell’ integrazione, gli ioni utilizzati come target sono stati selezionati dalla PCDL el’integrazione con i suddetti ioni si è dimostrata efficace e, nella quantificazione effettuata con il metodo di Sure Mass, il valore medio del coefficiente di varianza è risultato più basso rispetto all’analisi effettuata con il metodo della Deconvoluzione.
In conclusione, lamessa a punto del nuovo metodo, insieme alla realizzazione della PCDL, ha permesso di esplorare le capacità della massa accurata fornita dagli strumenti ad alta risoluzione, con tutti i vantaggi che ne conseguono in termini di efficienza, sicurezza nell’identificazione e nella quantificazione, anche rispetto a composti “unknown”.
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Abstract
In the field of Metabolomics, gas chromatography coupled with mass spectrometry is an important tool in the untarget analysis, as it is able to cover a wide range of compounds. This type of analytical platform provides a large amount of data that need to be processed and, currently, all literature and analysis protocols are based on the use of tools, such as libraries and databases, characterized by having fragments with nominal mass. However, despite the appearance of new instruments capable of exact mass resolution and their progressive improvement in accuracy, the problem of advancing data processing techniques has not yet been addressed.
The present thesis has been finalized to the set-up of a library of spectra with exact mass, obtained through analysis of biological samples and pure standards, analyzed with GC-MS-QTOF with high resolution, in order to develop a new methodology of data processing, which benefits from the presence of the exact mass of each spectral fragment.
For the realization of the above-mentioned library, more than 70 pure standard compounds were analyzed and, in a second stage, the compounds were also added from complex matrices, such as plasma, liver, kidney and hamster brain.
In the identification phase, a new algorithm for data processing called "Sure Mass", designed to exploit the new capabilities of the instruments with exact mass, provided by Agilent Technologies and incorporated in the software Unknown Analysis, was tested. The parameters were developed by analyzing a set of generic plasma sample and processing the data in parallel with the Deconvolution and Sure Mass method. Once the effectiveness of the new method was verified, this was applied to a Standard Reference Material 1950, a certificate plasma provided by NIST for the validation of new methods of analysis. A series of 10 replicates were the analyzed and subsequently processed with both the Deconvolution and Sure Mass methods, combined with the research in the PCDL library. The new method was found to be effective and reliable in increasing the number of compounds identified.
We then proceeded with the alignment of the data for the subsequent quantification phase, generating two methods: one with the matrix of data coming from the Deconvolution and one with those of Sure Mass.
During the revision of the integration, the ions used as targets were selected from the PCDL and the integration with the mentioned ions proved to be effective and, in the quantification carried out with the Sure Mass method, the average values of the Coefficient of Variation of the identified compounds was lower than the analysis carried out with the Deconvolution method.
In conclusion, the development of the new method, together with the implementation of the PCDL, allowed us to explore the capabilities of the accurate mass provided by the high resolution instruments, with all the consequent advantages in terms of efficiency and confidence in identification and in the quantification, which gives rise to several possibilities in the investigation of the "unknown" compounds.
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